微生物制藥中菌種準(zhǔn)備方法及改進(jìn)

王麗琴

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江杭州 310000）

微生物制藥主要利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的有生理活性的產(chǎn)物，針對生產(chǎn)過程的特殊性，在整個過程中需要明確實際類型，結(jié)合制藥類型和模式等實施。當(dāng)前，微生物制藥實驗管理程度復(fù)雜，考慮到代謝條件以及相關(guān)實驗設(shè)備等因素，要從實驗環(huán)節(jié)入手，提升生產(chǎn)管理水平。為了保證生物菌種的安全性，要求實驗人員從各個實驗環(huán)節(jié)做好準(zhǔn)備工作，滿足微生物制藥要求。

1 傳統(tǒng)的供種方法

四環(huán)素是由金霉素鏈霉菌經(jīng)孢子制備、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和提取而獲得的。根據(jù)發(fā)酵以及提取精制過程可知，菌種制備是源頭，需要提前做好準(zhǔn)備工作，以滿足實驗要求。在初期制備階段，相關(guān)實驗人員進(jìn)行試驗、如下：36 ℃培養(yǎng)7天左右，以F1代子斜面，為了保證實驗所需數(shù)量和孢子質(zhì)量，要擴(kuò)大培養(yǎng)F2代子斜面，設(shè)計人員在實驗的過程中，按照不同類型要求進(jìn)行。傳統(tǒng)的供種模式存在很多問題。

1.1 菌種的斜面轉(zhuǎn)接困難

菌種的斜面轉(zhuǎn)接是用接種環(huán)輕輕沾取一個試管中少量菌體和孢子，轉(zhuǎn)接到另外一支待接斜面試管上，但由于實驗人員較多，需要重復(fù)轉(zhuǎn)接的斜面較多，考慮到整個過程的特殊性，在整個分析階段，需要高度重視，做好制備工作。

1.2 斜面需求量大

微生物生長的影響因素較多，可能存在生長情況不好的現(xiàn)象。技術(shù)人員要結(jié)合多年的經(jīng)驗，結(jié)合試驗菌的特征進(jìn)行，此外考慮到形態(tài)和生理變異等因素，為了保證給其他工作人員提供符合試驗要求的菌種，以試驗項目為基礎(chǔ)，根據(jù)《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理方法》可知，需要提前確定使用規(guī)范，試驗結(jié)束后，對試管斜面提前處理，工作量較大，如果存在試驗制備不合理或者其他問題等，都可能造成不良影響[2]。

1.3 供種時間性強(qiáng)

受到其他因素的影響，如濕度、溫度和原材料等，菌種控制難度比較大，在整個處理階段，要做好處理工作。如果不能提前控制，菌種則易出現(xiàn)衰退、死亡或者變異等現(xiàn)象，導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降后，時間不好掌握[3]。

1.4 出發(fā)菌株不能統(tǒng)一

由于每個出發(fā)菌株的單一孢子轉(zhuǎn)接試管斜面的數(shù)量有限，不能保證所有研究人員所進(jìn)行的實驗組的使用生長情況一致，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)實際情況可知，這種情況不利于發(fā)酵過程中代謝條件的開展。在微生物制藥實驗中，考慮到菌種的準(zhǔn)備形式以及異常情況，要提前進(jìn)行研究和實踐。

2 改進(jìn)菌種準(zhǔn)備方式和可行性分析

2.1 改進(jìn)方式

由于菌種的類型較多，在整個分析階段，要了解菌絲體的實際情況。根據(jù)液體培養(yǎng)基的概況可知，震蕩培養(yǎng)的方式符合要求。以菌絲體保存方式為例，將震蕩培養(yǎng)后的菌絲體加保護(hù)劑后分裝至甘油管中，置于-28 ℃下進(jìn)行保存。冷凍菌絲體代替孢子斜面，將其提供給相關(guān)人員進(jìn)行項目試驗，如下：

沙土管→孢子培養(yǎng)→母斜面→種子液→供種

結(jié)合傳統(tǒng)的微生物制藥的模式可知，培養(yǎng)成熟孢子母斜面，以接種處理作為基礎(chǔ)，在后續(xù)試驗中，要做好種子液處理工作。每瓶菌絲萌發(fā)的種子液可以分裝至多個甘油管中，置于合適的溫度下保存，完成后續(xù)試驗。該方式的優(yōu)勢明顯，種子和孢子斜面用量少，在實驗檢查階段，需要明確準(zhǔn)備方式和要求，嚴(yán)格按照試驗要求實施。斜面?zhèn)鞔臅r間和后續(xù)大量的菌種滅活后洗刷工作量提升，需要節(jié)約人力、物力等投入，減少感染機(jī)會，保證穩(wěn)定生產(chǎn)和管理。此外種子生長較快，能加速孢子發(fā)芽，根據(jù)對應(yīng)的菌種以及準(zhǔn)備周期可知，在改進(jìn)處理過程中要明確實際優(yōu)勢，提升了可行性。同一批次的菌絲體生長背景一致，在發(fā)酵過程中，考慮到代謝條件以及試驗設(shè)計等要求，要明確可行性指標(biāo)，避免出現(xiàn)異常現(xiàn)象[4]。

2.2 菌絲體凍存時間分析

根據(jù)不同時間的菌絲體試驗條件可知，5%四環(huán)素接種量發(fā)酵過程中，采用新鮮的孢子斜面作為對照，能符合結(jié)果要求。凍存菌絲體作為試驗的主要部分，凍存兩周后，菌絲凍存時間延長后，四環(huán)素發(fā)酵單位呈現(xiàn)出下降趨勢，凍存1周后，菌絲變化不明顯，考慮到周期性變化和改進(jìn)流程可知，需要提前減少工作量[5]。

2.3 菌絲體接種量對四環(huán)素發(fā)酵影響考察

凍存時間以及菌絲體等屬于常見的試驗供種，結(jié)合不同接種量可知，在評價過程中，要提前處理，以新鮮孢子斜面供種為對照組，在測評階段要明確表格內(nèi)容，按照改進(jìn)格式要求實施。綜合分析試驗結(jié)果可知，在實驗調(diào)查過程中，要確定大范圍的結(jié)果。凍存1周的菌絲體供種發(fā)酵考察見表1。

表1 凍存1周的菌絲體供種發(fā)酵考察

菌絲體凍存的時間大約為7天，接種量為2 mL，轉(zhuǎn)種時間為22 h時，發(fā)酵單位和普通孢子發(fā)酵單位相當(dāng)，如果沒有下降，則可以按照說明書代替?zhèn)鹘y(tǒng)斜面進(jìn)行處理。

2.4 不同供種方式工作量對比

根據(jù)微生物實驗檢測的實際要求可知，做好分組管理是關(guān)鍵。正常情況下，實驗項目分配后，要確定成熟孢子斜面類型，如果孢子不能符合實際要求，則準(zhǔn)備32支以上的孢子斜面。以試管裝量為前提，要提前確定培養(yǎng)基數(shù)量。改進(jìn)的供種方式需要一只斜面，挖塊1 cm×2 cm孢子接種到液體培養(yǎng)基內(nèi)，震蕩培養(yǎng)是重要的過程，在簡化處理的過程中，要明確類型要求，簡化后的試驗處理是個重要的過程，洗刷后，要提前確定工作量[6]。

2.5 確定培養(yǎng)周期

根據(jù)改進(jìn)后的菌絲體供種類型可知，供種時間分為不同的類別，周期大約為1周。由于微生物制藥管理過程復(fù)雜，在實踐階段需要考慮到應(yīng)用周期和概況，做好斜面準(zhǔn)備以及孢子培養(yǎng)工作，確定斜面的數(shù)量。以試驗數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)，凍存菌絲體作為四環(huán)素發(fā)酵的供種來源，如何將其應(yīng)用到大范圍中是重點，以規(guī)?；芾碜鳛榛A(chǔ)，復(fù)雜的培養(yǎng)管理后，能適當(dāng)減少試驗準(zhǔn)備操作，縮短時間。試驗準(zhǔn)備是個全面的過程，凍存2周后，四環(huán)素發(fā)酵單位呈現(xiàn)出下降的趨勢，考慮到應(yīng)用周期和其他方面因素的變化，在整個處理過程中要突出應(yīng)用重點。

3 結(jié)語

微生物制藥管理是個全面的過程，考慮到應(yīng)用周期以及具體變化，大規(guī)模實驗人員在實驗分析的階段，必須做好菌種準(zhǔn)備工作，考慮到實驗準(zhǔn)備操作以及時間等方面因素，生物廢品較多，做好后續(xù)處理工作是重點，要改善實驗環(huán)境，節(jié)約人力和物力投入等。實驗周期的確定也是重點，在評價過程中需要確定接種量，如果存在準(zhǔn)備不到位或者改進(jìn)措施不合理等現(xiàn)象，則直接影響試驗結(jié)果，因此需要從各個方面入手，做好改進(jìn)工作，最大程度滿足應(yīng)用要求，實現(xiàn)菌種合理性。

[1]劉曉輝,郭萍,韓佳迪,等.微生物制藥實驗中菌種準(zhǔn)備方法改進(jìn)[J].實驗室科學(xué),2017,20(5):36-38,41.

[2]裴立忠,王勇平,張鵬,等.四環(huán)素類抗生素生產(chǎn)狀況與市場發(fā)展前[J].中國獸藥雜志,2015,12(1):96-98.

[3]何健勇.生物制藥工藝學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2016.

[4]祝琳.微生物實驗室菌種復(fù)蘇傳代保存流程[J].山東化工,2014,43(1):105-106.

[5]范慧.菌種管理在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].藥學(xué)研究,1999(1):60-62.

[6]楊怡姝,沈思嗣,王小利,等.大學(xué)生物學(xué)實驗室的生物安全問題探討[J].實驗技術(shù)與管理,2011,28(5):188-190.