25?羥維生素D3電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定及臨床應(yīng)用

李美珠，李堅鵬，李煒煊（佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東528000）

維生素D是一種脂溶性類固醇衍生物，是骨代謝的調(diào)節(jié)激素，具有抗佝僂病作用。由于維生素D在骨骼健康和維生素D缺乏癥中的重要作用，臨床醫(yī)生對于評估維生素D的需求日益增加。有研究表明，維生素D與糖代謝有著密切關(guān)系[1-2]。

目前，實驗室對25-羥維生素D3最常見的檢測方法有電化學(xué)發(fā)光免疫分析法和色譜法[包括高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）]。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法的檢測原理是指在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，采用三聯(lián)吡啶釕作為電化學(xué)發(fā)光劑來標記抗體，通過抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測抗原或抗體進行定量或定性。該方法樣品處理簡單，獲取結(jié)果時間較短。本研究用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法對總維生素D的性能進行分析，評價其是否符合臨床分析需求，以期成為適合臨床常規(guī)維生素D狀態(tài)評估的一個重要依據(jù)。

糖化血清清蛋白（GA）是反映過去1個月特別是最近2～3周平均血糖水平的一項指標。由于該指標與紅細胞壽命變化無關(guān)，比以前血糖檢測“金標準”糖化血紅蛋白（HbA1c）的反應(yīng)周期要短。因糖尿病治療開始時血糖值多會出現(xiàn)劇烈波動情況，HbA1c不能立即捕捉到這一變化，而GA可以反映血糖變化。所以，確認糖尿病治療開始時的治療效果時，GA比HbA1c更為靈敏，可作為檢測血糖變化的指標。因此，GA更具有血糖水平控制和預(yù)后診斷的臨床意義。

本研究采用競爭法和酶法對糖尿病患者血清25-羥維生素D3和GA%水平進行檢測，分析探討哪種方法更適用于全自動免疫分析儀常規(guī)檢測，25-羥維生素D3水平與糖尿病GA%是否具有良好的相關(guān)性及二者與糖尿病腎病的相關(guān)性是否可作為糖尿病血糖水平控制和預(yù)后診斷的敏感指標，具有實際的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年5月在本院腎內(nèi)科住院并明確診斷的216例患者，所有患者均患有糖尿病。糖尿病診斷根據(jù)1999年制定的WHO糖尿病診斷標準；糖尿病腎病根據(jù)2007年美國腎臟病基金會修訂的診斷標準。根據(jù)診斷標準將其分為糖尿病組（140例）和糖尿病腎病組（76例）。糖尿病組中男75例，女 65例；年齡 35～81 歲，平均（54.40±4.12）歲。糖尿病腎病組中男43例，女33例；年齡33～78歲，平均（55.70±4.36）歲。另隨機選取本院體檢健康者72例作為健康對照組，其中男40例，女32例，年齡30～75歲，平均（53.60±4.50）歲。

1.1.2 儀器及試劑 采用羅氏Cobas全自動免疫分析儀，試劑由羅氏公司提供，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測了25-羥維生素D3水平。根據(jù)維生素D營養(yǎng)狀況的評估可分為 3組：25-羥維生素D3≥30 ng/mL 為充足；20～＜30 ng/mL為不足；＜20 ng/mL為缺乏。

1.1.3 標本采集 采集受檢者靜脈血4 mL于分離膠促凝真空采血管中送檢，立即3 000 r/min離心5 min，分離血清后2 h內(nèi)檢測。

1.2 檢測方法 25-羥維生素D3采用電化學(xué)發(fā)光法，在羅氏Cobas型全自動免疫分析儀上檢測；GA%采用酶法在西門子（SIEMENS）ADVIA2400流水線檢測，分別定量檢測GA和清蛋白，然后GA%=GA濃度/清蛋白濃度×100%。實驗方法嚴格按照試劑盒說明書和SOP文件進行操作；并對檢測結(jié)果進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 精密度測試

2.1.1 批內(nèi)變異系數(shù)（CV） 分別檢測高、中、低3個不同濃度的25-羥維生素D3水平，每天測定3次，共5 d。批內(nèi)CV≤3.3%。見表1。

表1 批內(nèi)精密度試驗

2.1.2 批間CV 把1份混合血清標本分裝成15小支放冰格，每天拿1支測定25-羥維生素D3水平，共15 d。結(jié)果平均水平為（23.3±2.2）ng/mL，CV為4.8%。

2.2 線性試驗 按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）EP6-P2 方案[3]，選擇 25-羥維生素D3值為 55.6、3.2 ng/mL的血清標本各1份，然后將2份血清按3∶1、1∶1和 1∶3 的比例混合，產(chǎn)生 55.6、42.5、29.4、16.3、3.2 ng/mL 5個不同濃度的標本，用本法重復(fù)測定4次，將測定值（Y）與理論值（X）進行線性回歸分析，r=0.995，線性回歸方程Y=1.030X+1.102，說明在3.2～55.6 ng/mL內(nèi)線性良好。

2.3 正確度驗證 方案：取5份標本在用該方法與某醫(yī)院檢驗中心結(jié)果比對，得出結(jié)果偏移未超過允許范圍，比對結(jié)果通過，故正確度驗證通過，總維生素D正確度符合要求。見表2。

表2 本科室與某醫(yī)院檢驗中心的比對結(jié)果

2.4 3組25-羥維生素D3和GA%值結(jié)果比較 糖尿病組與糖尿病腎病組的25-羥維生素D3水平較健康對照組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；糖尿病組與糖尿病腎病組的GA%值較健康對照組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 3組25-羥維生素D3水平和GA值結(jié)果比較

2.5 糖尿病腎病組維生素D不同營養(yǎng)狀況下GA值比較 糖尿病腎病患者的GA%值隨25-羥維生素D3水平的降低而呈升高趨勢，且GA%值與25-羥維生素D3呈負相關(guān)（rs=-0.42，P＜0.05）。見表4。

表4 糖尿病腎病組維生素D不同營養(yǎng)狀況下GA%值比較

3 討 論

隨著人民生活水平的不斷提高，糖尿病已成為常見疾病。目前，我國成年人群中糖尿病總體發(fā)病率已達11.6%。糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生是造成糖尿病患者死亡的重要原因，在我國，糖尿病腎病已成為終末期腎病的最主要病因。由于25-羥維生素D3是人體內(nèi)維生素D主要儲存的活性形式，且較為穩(wěn)定，在人體內(nèi)半衰期較長（常為3周左右），因此，通過檢測25-羥維生素D3可以確定體內(nèi)總維生素D情況[4]。

本研究結(jié)果顯示，電化學(xué)發(fā)光法25-羥維生素D3測定試劑盒的批內(nèi)CV≤3.3%、批間CV為4.8%，線性范圍3.2～55.6 ng/mL，精密度和正確度較高，能滿足臨床測定的需要。本方法優(yōu)點有以下方面：（1）對樣本無須預(yù)處理，采用全自動免疫分析儀，操作簡便、快速，可在短時間內(nèi)得出檢測結(jié)果；（2）該法適用于標本量少、采血困難的兒科等科室；（3）成本低，較低收費標準可減輕患者經(jīng)濟負擔(dān)；（4）羅氏診斷電化學(xué)發(fā)光免疫分析法總維生素D的整體性能好；（5）具有測定結(jié)果重復(fù)性好、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，具有很好的臨床應(yīng)用價值。

近年來，有學(xué)者研究顯示，維生素D水平與心血管疾病、糖代謝疾病及糖尿病等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5-7]。本研究結(jié)果表明，隨著25-羥維生素D3水平逐漸降低，GA%逐漸升高，糖尿病腎病的危險性存在增高趨勢，與文獻[8-9]研究結(jié)果一致，說明糖尿病的發(fā)生、發(fā)展與25-羥維生素D3、GA水平的變化有關(guān)。通過相關(guān)性分析結(jié)果表明，糖尿病腎病患者的GA%值隨著25-羥維生素D3水平的降低而呈升高趨勢，表明GA%值與25-羥維生素D3呈負相關(guān)。有研究通過單基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，維生素D等位基因是糖尿病腎病的易感基因［10-11]。有學(xué)者研究認為，予以2型糖尿病患者補充維生素D后，患者血糖水平明顯降低，維生素D與胰島素敏感性及胰島素分泌存在密切關(guān)系[12]。

綜上所述，25-羥維生素D3缺乏與GA水平升高可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過程，因此，監(jiān)測血清25-羥維生素D3水平與GA水平對糖尿病腎病的預(yù)防和預(yù)后有重要意義。而及時補充維生素D3和降低GA水平可能是預(yù)防糖尿病腎病發(fā)生，減緩糖尿病腎病進展的一個重要途徑。本研究表明，GA%值與25-羥維生素D3水平呈負相關(guān)。因此，糖尿病患者同時檢測25-羥維生素D3與GA水平能夠更好地對病情進行評估，對于糖尿病患者定期監(jiān)測這2個指標的變化可及時采取有效治療措施，對預(yù)防糖尿病腎病發(fā)生、減緩糖尿病腎病進展起到關(guān)鍵作用。

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