大黃酸對(duì)非酒精性脂肪肝病模型大鼠干預(yù)作用及對(duì)血清IL-1β、IL-6的影響

呂媛琳劉晨晨劉 慧張仙土喬 梁包劍鋒

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD）是目前最為常見的一種慢性肝病，其發(fā)病率在亞洲地區(qū)20年內(nèi)升高2%[1]。NAFLD以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)貯積和脂肪變性為特征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）[2-3]。目前我國非酒精性脂肪肝的發(fā)病率約為15%，是肝纖維化、肝硬化甚至是肝細(xì)胞癌的重要促進(jìn)因素[4]。然而NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年研究表明，胰島素抵抗與炎癥反應(yīng)在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。白細(xì)胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）是白細(xì)胞介素 1（IL-1）家族的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、肝胰島素抵抗等作用[7]。白細(xì)胞介素 6（interleukin 6，IL-6）作為炎癥介質(zhì)具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其濃度高低也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[8]。研究[9]表明，IL-1β、IL-6 可以促進(jìn)肝臟炎癥，誘發(fā)脂肪變性。大黃酸是中藥大黃的提取物，大黃具有清熱解毒、通腑瀉熱、活血消癰等功效。大黃可通過改善胰島素抵抗（insulin resistance，IR），糾正低脂聯(lián)素血癥和脂代謝紊亂等途徑，逆轉(zhuǎn)大鼠NAFLD的肝脂肪變性和肝功能異常[10]；可改善肝細(xì)胞脂肪變和炎性浸潤，減輕線粒體變形和腫脹[11]；采用不同劑量大黃素治療后，可顯著降低血脂和肝脂,改善肝功能[12]。本研究旨在觀察大黃酸對(duì)NAFLD干預(yù)作用及其對(duì)血清IL-1β、IL-6的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 雄性SD大鼠40只，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013－0016。體質(zhì)量（200±20）g，清潔級(jí)，購于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度18～20℃，濕度50%左右。

1.2 藥物及試劑 高脂飼料（貨號(hào)TP-2003，購自南通特洛菲飼料科技有限公司）；果糖（批號(hào)57-48-7，購自湖北賽創(chuàng)生物科技有限公司）；大鼠IL-6 Elisa試劑盒（批號(hào)L360014S，美國Bio-Rad）；大鼠IL-1βElisa試劑盒（批號(hào) L474307S，美國 Bio-Rad）；大黃酸（批號(hào)NF-20151124，購自西安天豐生物科技有限公司）。

1.3 儀 器 1000mL燒杯：華東醫(yī)藥有限公司；37℃恒溫箱：日本日立公司；精密移液器及一次性吸頭：美國Bio-Rad；自動(dòng)化酶免分析儀：鄭州安圖生物有限公司；離心機(jī)KUBOTA6200型：日本KUBOTA公司；日立7180全自動(dòng)生化分析儀：日本日立公司；精密稱量儀：賽多利斯科學(xué)有限公司；低速離心機(jī)：上海安亭儀器有限公司；自動(dòng)洗板機(jī)：日本KUBOTA公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 40只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組10只，模型組20只，大黃酸組10只。對(duì)照組大鼠喂飼普通中性飼料（脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)分別提供13%、65%、22%的能量）+普通飲用水，模型組和大黃酸組大鼠喂飼高脂飼料（脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)分別提供45%、33%、22%的能量）+10%果糖水，造模8周。8周后，模型組處死10只HE染色，判斷造模是否成功。

2.2 給 藥 造模成功后，對(duì)照組和模型組大鼠分別給予生理鹽水10mg/kg灌胃，每天1次，大黃酸組予大黃酸100mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)給藥8周，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲食。實(shí)驗(yàn)過程中，由于灌胃操作不規(guī)范造成模型組與對(duì)照組大鼠死亡各1只。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一般觀察 每周對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝濕重、進(jìn)食量及進(jìn)水量進(jìn)行測(cè)量和記錄，觀察各組大鼠皮毛光澤度，糞便，以及大鼠的精神狀態(tài)。

2.3.2 標(biāo)本處理 16周后，末次給藥后禁食12h，3%戊巴比妥納30mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，無菌條件下解剖大鼠，腹主動(dòng)脈取新鮮血液10mL，室溫靜置20min后分離血清，于超低溫離心機(jī)4℃，3000r/min，15min分離血清，取上清液，置-80℃，備用。

2.3.3 血生化指標(biāo)及血清IL-1β、IL-6檢測(cè) 采用PHOMO自動(dòng)化酶免分析儀檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alaninne aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（Total cholesterol，TG）、甘油三酯（triglycerides，TC）、空腹血糖（glucose，GLU）。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 測(cè)定血清白介素 1β（IL-1β）和血清白介素 6（IL-6）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況 給藥前，對(duì)照組行為活躍，反應(yīng)靈敏，食欲好，皮毛光整，無脫毛現(xiàn)象，體質(zhì)量穩(wěn)定增長，大便呈顆粒狀、色黃、質(zhì)硬。模型組體型肥胖，反應(yīng)遲鈍，皮毛蓬亂，毛色發(fā)黃，欠光澤，后期出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象、食欲減退，大便呈顆粒狀、色黑、質(zhì)硬。給藥后，大黃酸組體質(zhì)量下降，皮毛微黃，光澤可，脫毛少見，反應(yīng)較為靈敏，大便質(zhì)稀、不成型。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量和肝濕重比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和肝濕重明顯增加（P＜0.05）;與模型組比較，大黃酸組大鼠體質(zhì)量和肝濕重明顯降低（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝濕重比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝濕重比較（g，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

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3.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6水平升高（P均＜0.05）。與模型組比較，大黃酸組大鼠血清IL-1β、IL-6水平降低（P均＜0.05），見表 2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6 水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6 水平比較（pg/mL，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

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3.4 各組大鼠肝臟病理變化 對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無肝細(xì)胞腫脹及脂肪變性，匯管區(qū)無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肝臟細(xì)胞呈大泡性脂肪變性為主的混合性脂肪性病變，可見氣球樣變，匯管區(qū)及肝竇出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤和偶可見散在的點(diǎn)狀壞死；大黃酸組大鼠肝細(xì)胞脂肪變程度明顯減輕，肝細(xì)胞排列緊密，匯管區(qū)未見炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1（插頁）。

3.5 各組大鼠血生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 明顯增加（P＜0.05）;與模型組比較，大黃酸組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、GLU 明顯降低（P 均＜0.05），見表 3。

表 3 各組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 水平比較（±s）

表 3 各組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

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4 討論

中醫(yī)文獻(xiàn)中并無脂肪肝病名,但根據(jù)其發(fā)病特征和臨床表現(xiàn)及致病因素應(yīng)屬“肥氣”、“脅痛”、“積聚”、“脹滿”、“痰濁”、“黃疽”等范疇。其多由飲食膏粱厚味，脾失健運(yùn)，肝腎陰虧，氣機(jī)瘀滯，血脈不暢而致。大黃具有瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效，而大黃酸是大黃的主要提取物，屬蒽醌類衍生物，具有瀉下、抑菌、止血、促進(jìn)膽汁分泌、降脂、降壓和抗腫瘤作用[13]。近年研究[14-15]顯示，對(duì)脂肪肝、藥物性肝損傷等具有保護(hù)作用，同時(shí)可通過多個(gè)靶蛋白發(fā)揮抗炎作用。

本研究結(jié)果表明，大黃酸組體質(zhì)量、肝濕重較模型組明顯降低，且 ALT、AST、TC、TG、GLU 明顯降低（P＜0.05），提示大黃酸可以抑制肝臟脂質(zhì)沉積。而NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，但胰島素抵抗（IR）與炎癥進(jìn)展是其重要環(huán)節(jié)。IL-1β作為IL-1家族的一員，有研究表明在飲食誘導(dǎo)的肥胖模型中，IL-1β的表達(dá)可誘導(dǎo)肝臟炎癥和肝纖維化[16]。同時(shí)IL-1β可促進(jìn)胰島β細(xì)胞的一氧化氮生成和細(xì)胞凋亡，從而選擇性破壞胰島β細(xì)胞導(dǎo)致IR，最終促進(jìn)NAFLD發(fā)病[17]。本研究造模后，大鼠血清IL-1β明顯升高，而大黃酸干預(yù)后其表達(dá)明顯降低，提示大黃酸可能通過抑制IL-1β的表達(dá)從而達(dá)到減緩炎癥以及胰島素抵抗治療脂肪肝。

白介素6（IL-6）是預(yù)測(cè)或者導(dǎo)致胰島素抵抗的關(guān)鍵細(xì)胞因子[18]。研究[19]表明，IL-6在肥胖患者中的表達(dá)比BMI正?；颊吒?0%，提示IL-6可能參與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。而IL-6可激活Shc/ERK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路及PI3K/AKT信號(hào)通路，從而促經(jīng)炎癥反應(yīng)[20]。本研究造模后，大鼠血清IL-6明顯升高，大黃酸干預(yù)后其表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），提示大黃酸可能通過抑制IL-6的表達(dá)從而達(dá)到減緩炎癥以及胰島素抵抗治療脂肪肝。

綜上所述，大黃酸可能通過抑制NAFLD大鼠血清IL-1β、IL-6表達(dá)，從而改善炎癥水平，減少脂質(zhì)沉積，改善肝臟脂肪變性。

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