滅幽湯對幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎小鼠胃黏膜組織TLR2、NF-κBp65的影響

王小娟，尹 姣，郭建生，喻 斌*，杜中華，羅 燕，夏 蓉

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

滅幽湯對幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎小鼠胃黏膜組織TLR2、NF-κBp65的影響

王小娟1，尹 姣2，郭建生2，喻 斌2*，杜中華2，羅 燕2，夏 蓉2

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

目的 探討滅幽湯對幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（HAG）小鼠胃黏膜組織Toll樣受體2（TLR2）、核轉(zhuǎn)因子p65（NF-κBp65）的影響。方法 將BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、模型組、胃三聯(lián)組、滅幽湯組。采用復(fù)合因素（肥甘食物+濕熱環(huán)境+幽門螺桿菌）建立BALB/c小鼠HP相關(guān)性胃炎脾胃濕熱證模型。采用免疫組化法檢測胃黏膜組織TLR2、NF-κBp65的蛋白表達情況。結(jié)果 小鼠模型組與正常對照組比較TLR2與NF-κBp65表達均增加（P＜0.05）；與模型組比較，滅幽湯組小鼠胃黏膜TLR2與NF-κBp65表達均降低(P＜0.05)。結(jié)論 滅幽湯能根除HP，可減輕HP引起的胃黏膜炎癥反應(yīng)。其機制可能是通過下調(diào)TLR2，抑制NF-κBp65的激活，從而阻止NF－κB的活化，減輕胃粘膜炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮其治療作用。

幽門螺桿菌；胃炎；滅幽湯；Toll樣受體2；核轉(zhuǎn)因子p65

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)是一種革蘭氏陰性細菌，寄居于人的胃黏膜中。作為一種環(huán)境致病因素，HP感染是引起胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要因素，對人類健康構(gòu)成嚴重危害[1-4]。因此，根除HP成為治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（HAG）的重要課題。滅幽湯是臨床治療HAG的有效復(fù)方[5-12]，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步從分子生物學角度探討滅幽湯對HAG小鼠胃組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級BALB/c小鼠56只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量（20±5）g，小鼠購進后常規(guī)飼養(yǎng)，室溫(20±2)℃，照明晝夜交替時間為12 h∶12 h，自由飲水、進食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，飲食飲水正常、無不良反應(yīng)者，即納入實驗。動物購自南京君科生物科技有限公司。實驗動物質(zhì)量合格證號：0017145，許可證號：SCXK（蘇）2011-0003。

1.1.2 HP菌菌種 悉尼標準菌株 （Sydney strain 1，SSI)，SSI含有細胞毒素相關(guān)基因(cagA)蛋白和空泡細胞毒素(vacA)，濃度為HP菌液1×109cfu/mL，由湖南中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原免疫學教研室提供。

1.1.3 實驗造模飼料 普通飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，高糖高脂飼料（普通飼料+ 8%蜂蜜+12%豬油）由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司代加工。

1.1.4 藥物 中藥：滅幽湯 （黃芩15 g，蒲公英20 g，陳皮10 g，青皮10 g，白及10 g，三七6 g，烏賊骨15 g），以上飲片均購于湖南省藥材公司飲片加工廠，飲片浸泡30 min后，加水沒過藥面5 cm，武火煎至沸騰后改文火，繼續(xù)煎煮20 min，取汁另置。繼續(xù)加水，煎煮沸騰后，文火續(xù)煎20 min，取汁。兩次藥汁合并后濃縮至含生藥2 g/mL，并用離心機去除藥汁中殘渣，4℃保存。胃三聯(lián)西藥：枸櫞酸鉍鉀由麗珠醫(yī)藥出廠，生產(chǎn)批號：1212248。替硝唑由山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責任公司出廠，國藥準字：H20033090?？死顾赜珊贾葜忻廊A東制藥有限公司出廠，國藥準字：H10970216。按照小鼠與人臨床用藥劑量、體型系數(shù)公式dB=dA×RB/RA×(WA/ WB)1/4計算小鼠用藥劑量，胃三聯(lián)組小鼠用藥劑量均為279.8 mg/kg（參考60 kg成人劑量，成人每次用藥劑量為鉍劑220 mg＋替硝唑500 mg＋克拉霉素250 mg，2次/d），滅幽湯組用藥劑量為12.4 g/kg。

1.1.5 試劑 膠體金法HP檢測試劑盒，艾康生物技術(shù) （杭州）有限公司。一抗兔抗鼠核轉(zhuǎn)因子p65（NF-κBp65）（批號BA0610）、Toll樣受體2（TLR2）（批號BA1716），均購自武漢博士德生物工程有限公司，生物素標記二抗試劑盒（批號sp9002），購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。常規(guī)化學試劑購自北京化學試劑公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司。

1.1.6 儀器 民橋電子天平；中科美菱-80℃冰箱；eppendorf臺式冷凍離心機；英國Shandon 325型石蠟切片機；德國LEICA LEICA DM LB2型雙目顯微鏡；麥克奧迪實業(yè)集團公司Motic B5顯微攝像系統(tǒng)。自制人工濕熱箱：已獲得專利，專利號：201320293029.4。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將56只BALB/c小鼠按體質(zhì)量分層隨機分為正常對照組、模型組、胃三聯(lián)組、滅幽湯組，每組14只。正常對照組予以普通飼料正常飼養(yǎng)，模型組、胃三聯(lián)組、滅幽湯組予以高脂飼料飼養(yǎng)10 d，然后放入人工濕熱箱[溫度(35±2)℃，濕度95%±1%]內(nèi)繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，于第16天以濃度為1×109cfu/ml HP混懸液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h給食水。隔日感染1次，連續(xù)感染3次。感染后定植2周。2周后所有小鼠均斷尾取血以膠體金法檢測HP；抽樣取胃黏膜做病理切片觀察炎癥情況，以及電鏡下觀察HP定植情況。

1.2.2 給藥及樣本處理 滅幽湯和胃三聯(lián)組在模型成功后開始給藥，每天灌胃1次，其它組分別灌等量的蒸餾水。給藥后兩周禁食禁水24 h后所有小鼠斷尾取血用于通過膠體金法檢測HP，采用頸椎脫臼法處死所有小鼠，將BALB/c小鼠仰臥位固定于鼠板，迅速取出胃標本。取胃前，將幽門部和賁門部結(jié)扎，在兩結(jié)扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗干凈。每組按隨機數(shù)字表法隨機抽取4個胃組織標本，全部放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h，石蠟包埋，備做免疫組化檢測。

1.2.3 指標檢測及方法 （1）膠體金法檢測HP，電鏡下、光鏡下分別觀察HP定植情況及 HE染色觀察胃黏膜炎癥程度。（2）免疫組化檢測TLR2、NF-κBp65蛋白表達：將小鼠胃組織石蠟切片放入二甲苯5 min×3次，然后依次經(jīng)梯度酒精脫蠟至水，并用PBS清洗5 min×3次；浸入3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，2 min×3次；65℃烤片2 h后，常規(guī)脫蠟至水；高溫檸檬酸鹽修復(fù)20 min；放入3%H2O2溶液中浸泡10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；0.01 M PBS洗3 min×2次；滴加 100 μL正常山羊血清封閉15 min，傾去溶液；分別加入一抗兔抗鼠TLR2、NF-κBP65，4℃孵育過夜；0.01 M PBS洗 3 min×2次；加入通用型生物素標記二抗100 μL，37℃30 min，0.01 M PBS洗3 min×2次；加入過氧化物酶標記鏈霉卵白素100 μL，37℃ 20 min，0.01 M PBS洗3 min×2次；滴加DAB顯色劑3~5 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。樣本圖像采用CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行分析。每個樣本隨機選取5個高倍視野，計算黃褐色陽性表達的面積，以此表示TLR2及NF-κBp65蛋白的表達，然后進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為和體態(tài)變化

造模前，小鼠活動正常，納香，大便正常，模型組體質(zhì)量與對照組比較無統(tǒng)計學差異；造模前期小鼠體質(zhì)量增長較快，后期逐漸變緩，甚至體質(zhì)量減輕，精神正常，納呆少飲，嗜睡，活動少，毛發(fā)松弛毛糙，陰囊松馳下垂，大便干稀不調(diào)，肛溫較造模前升高，小便色黃。給藥后，滅幽湯組小鼠體質(zhì)量逐漸增加，皮毛逐漸順滑，飲水、飲食量增多，活動變多。模型組小鼠仍納差，飲水減少，嗜睡，活動少，毛發(fā)松弛毛糙，陰囊松馳下垂，大便干稀不調(diào)，肛溫較造模前升高，小便色黃，說明滅幽湯組在改善小鼠攝食、大便等癥狀方面作用明顯。

2.2 各組小鼠陰轉(zhuǎn)率、組織病理學的比較

模型組小鼠血清HP抗體檢測陽性，藥物治療組治療前后膠體金法HP檢測統(tǒng)計結(jié)果（見表1），與模型組比較，滅幽湯組、胃三聯(lián)組治療后比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；滅幽湯組和胃三聯(lián)組治療后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 HP感染小鼠膠體金法HP檢測結(jié)果 （只）

HP定植情況：模型組電鏡下均發(fā)現(xiàn)有HP的定植，透射電鏡下觀察到小鼠胃幽門部黏膜表面HP聚集生長；甚至有些小鼠黏膜層細胞水腫，部分HP侵入到黏膜層。見圖1。

各組小鼠胃組織病理改變：光鏡下，正常組小鼠胃黏膜表面光滑，無明顯充血水腫、糜爛，腺體排列整齊。模型組小鼠胃竇部的炎癥程度重，小鼠胃黏膜充血腫脹，表面欠光整，腺體排列較紊亂，可見較多的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，炎癥細胞甚至到達黏膜下層，甚至可見黏膜的出血。胃三聯(lián)治療組炎癥程度明顯減輕，固有層僅有水腫，少量淋巴細胞。滅幽湯組小鼠胃黏膜表面稍欠光滑，僅固有層有水腫、無糜爛，腺體排列整齊，僅有少量淋巴細胞浸潤。見圖2（封三彩圖）。

圖1 電鏡下HP定值觀察

2.3 各組小鼠胃黏膜NF-κBp65免疫組化結(jié)果

免疫組化圖片中黃褐色區(qū)域為陽性表達。光鏡下觀察，空白組小鼠胃黏膜組織NF-κBp65僅有少量陽性表達；模型組有大量陽性表達；滅幽湯組和胃三聯(lián)組小鼠胃黏膜組織有少量NF-κBp65陽性表達，明顯少于模型組。見圖3（封三彩圖）。

正常組小鼠胃黏膜組織中均有少量 NF-κBp65蛋白表達。與正常組比較，模型組小鼠胃黏膜NF-κBp65蛋白表達增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯(lián)組小鼠胃黏膜NF-κBp65蛋白表達降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；滅幽湯組與胃三聯(lián)組比較，NF-κBp65表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠胃黏膜組織NF-κBP65蛋白表達的比較（±s，n=8）

表2 各組小鼠胃黏膜組織NF-κBP65蛋白表達的比較（±s，n=8）

注：與正常組比較＃P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01。下表同。

組別正常組模型組胃三聯(lián)組滅幽湯組藥物劑量——279.8 mg/kg 12.4 g/kg NF-κBP65（×103μm2）189.13±66.14 1 605.90±288.04#453.89±145.32** 421.49±137.32**

2.4 各組小鼠胃黏膜TLR2免疫組化結(jié)果

免疫組化圖片中黃褐色區(qū)域為陽性表達。光鏡下觀察，空白組小鼠胃黏膜組織TLR2幾乎無陽性表達；模型組小鼠胃黏膜組織TLR2有大量陽性表達；滅幽湯組和胃三聯(lián)組小鼠胃黏膜組織有少量TLR2陽性表達，明顯少于模型組。見圖4（封三彩圖）。

正常組小鼠胃黏膜組織中僅有少量TLR2蛋白表達。與正常組比較，模型組小鼠胃黏膜TLR2蛋白表達增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯(lián)組小鼠胃黏膜TLR2表達降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；滅幽湯組與胃三聯(lián)組比較，TLR2表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠胃黏膜組織TLR2蛋白表達的比較（±s，n=8）

表3 各組小鼠胃黏膜組織TLR2蛋白表達的比較（±s，n=8）

組別正常組模型組胃三聯(lián)組滅幽湯組藥物劑量——279.8 mg/kg 12.4 g/kg TLR2（×103μm2）118.48±48.54 1 580.52±276.82#339.70±120.37** 327.68±76.99**

3 討論

Toll樣受體是一種定位于細胞膜的跨膜蛋白，可感知病原體的存在并啟動機體防御相關(guān)基因的表達，從而發(fā)揮抵抗細菌感染的作用[13]，其中TLR2研究較多且作用相對明確。TLR2作為主要分布于單核/巨噬細胞的一種主要TLRs，能分別識別G+菌成分和G-菌成分等病原體的模式識別受體，通過在侵入部位導(dǎo)致該轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)位與相應(yīng)免疫基因的活化而轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生促炎細胞因子、趨化因子及其他炎癥介質(zhì)等起到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用[14-15]。國外學者研究表明HP感染及其菌體成分可上調(diào)TLR的表達[16]，Kawahara和Takenaka等[17-18]研究證實HP及其脂多糖和熱休克蛋白60(Hsp60)通過TLR尤其是TLR2信號通路激活NF-κB和刺激白細胞介素-8（IL-8）分泌，引起炎癥反應(yīng)。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是普遍存在于細胞質(zhì)中的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，位于TLR下游信號通路的樞紐位置。在靜息狀態(tài)下，NF-κB大多以p65，p50蛋白二聚體與NF-κB抑制因子(IKB)偶聯(lián)，以無活性的復(fù)合體形式存在于細胞質(zhì)中。與IKB解離的NF-κBp65可反映NF-κB的活性。IKKβ[19]是I-κB磷酸化激酶，它誘導(dǎo)IκB磷酸化，使NF-κB/I-κB二聚體解離，暴露NF-κB的核定位片段是NF-κB活化和移位的前提?；罨腘F-κB能與DNA特定的kB位點結(jié)合，啟動和調(diào)節(jié)眾多參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素(IL-lβ、IL-6、IL-8)等細胞因子和細胞間黏附分子-l(VCAM-1)等黏附分子的表達，在機體的炎癥、免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。本研究組前期已證實[12]，滅幽湯可能通過影響NF-κB和IKKβ的蛋白表達達到治療HAG的作用。

HAG歸屬于中醫(yī)胃脘痛、痞滿、嘈雜、反酸等范疇，絕大多數(shù)的研究結(jié)果顯示慢性胃病脾胃濕熱證的HP感染率較高[20-23]。 滅幽湯方[5-12]是王小娟教授結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗組方而成，以清熱利濕為基本組方原則。方以黃芩、蒲公英清熱燥濕解毒藥為君，以除脾胃之濕熱；青皮、陳皮行肝脾氣滯以疏通氣機；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陳皮協(xié)調(diào)氣血之運行，又收斂生肌修復(fù)局部之病灶；重用烏賊骨制酸止痛而為之使?，F(xiàn)代研究表明：黃芩、蒲公英能抗多種病原微生物，對多種球菌和桿菌有殺滅作用；烏賊骨含有豐富碳酸鹽和磷酸鹽能改變胃的酸性內(nèi)環(huán)境，抑制HP的生長；白及祛腐生肌可修復(fù)糜爛的胃黏膜；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，能促進血液循環(huán)消除組織水腫，促進黏膜增生，加快修復(fù)。

本實驗采取復(fù)合因素（肥甘食物+濕熱環(huán)境+幽門螺桿菌）建立脾胃濕熱型HAG小鼠模型，模型成功評定：小鼠以膠體金法檢測HP顯示陽性、電鏡下實驗組均發(fā)現(xiàn)有HP的定植；小鼠一般生理表現(xiàn)：精神萎頓，好睡，活動少，納呆，飲水減少，毛發(fā)松弛毛糙，陰囊松馳下垂，大便偏稀，小便色黃，體質(zhì)量減輕，肛溫升高；光鏡下HE染色觀察胃黏膜炎癥程度，發(fā)現(xiàn)小鼠胃黏膜充血腫脹，表面欠光整，腺體排列較紊亂，可見較多的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，甚至到達黏膜底層，黏膜未見糜爛。

本研究結(jié)果顯示：TLR2、NF-κBp65在模型組中表達均高于正常組，給予滅幽湯干預(yù)后TLR2、NF-κBp65明顯降低，HAG小鼠胃黏膜組織炎癥亦明顯減少，說明根除幽門螺桿菌后能下調(diào)TLR2、抑制NF-κBp65的激活，從而阻止NF-κB的活化，進而達到抗炎作用。因而我們推測滅幽湯可能是通過選擇此靶點來治療HAG。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Mieyou Decoction on TLR2 and NF-κBp65 in Gastric Mucosa Tissues of Mice with Helicobacter pylori-related Gastritis

WANG Xiaojuan1,YIN Jiao2,GUO Jiansheng2,YU Bin2*,DU Zhonghua2,LUO Yan2,XIA Rong2
（1.The first Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007, China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 401208,China）

Objective To explore effects and action mechanism of Mieyou Decoction on TLR2 and NF-κBP65 in gastric mucosa tissues of mice with Helicobacter pylori-related gastritis Methods BALB/c mice were randomly assigned to normal control group,model group,gastric triad group,Mieyou group,developed a model of HAG BALB/c mice Spleen-stomach Damp-heat Syndrome by composite factors (high sugar and fat food+hot and humid environment+H. Pylori).The immunohistochemical assay was adopted to detect the protein expressions of nuclear transcriptionfactorTLR2andNF-κBP65.ResultsComparedwithnormalcontrolgroup,theexpressions of TLR2 and NF-κBp65 in gastric mucosa of mice(model group)increased (P＜0.05),compared with model control group,the expressions decreased in Mieyou Decoction group (P＜0.05).Conclusion Mieyou Decoction can eradicate H．pylori,regulate the expressions of TLR2 and NF-κBp65 in gastric mucosa of mice,alleviate gastric mucosal inflammation.HAG was treated by Mieyou Decoction probably through down-regulating the expressions of TLR2, inhibiting the activation of NF-κBp65,thus hindering the activation of NF-κB,then producing treatment effect.

H.pylori;Gastritis;Mieyou Decoction;TLR2；NF-κBp65

R573.3；R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.004.018.05

2013－10－08

湖南省自然科學基金資助項目(12JJ2046)；湖南省科技廳科研資助項目(2011SK3096)；湖南省科普計劃資助項目(2013KP0111)；湖南中醫(yī)藥大學研究生校級科研資助項目。

王小娟，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病研究。

*喻 斌，男，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：272445871@qq.com。