尋常型銀屑病血熱證患者外周血Th17細(xì)胞活化和增殖相關(guān)因子的表達(dá)

田海剛，吳厚男，王建峰，郭付云，黃彬彬，楊旭芳，苗朝陽(yáng)，張曉艷*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；

3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100083；5.中日友好醫(yī)院皮膚科，北京 100029）

尋常型銀屑病血熱證患者外周血Th17細(xì)胞活化和增殖相關(guān)因子的表達(dá)

田海剛1，吳厚男2，王建峰1，郭付云1，黃彬彬1，楊旭芳3，苗朝陽(yáng)4，張曉艷5*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；

3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100083；5.中日友好醫(yī)院皮膚科，北京 100029）

目的 探討Th17細(xì)胞活化和增殖相關(guān)因子在尋常型銀屑病血熱證發(fā)病機(jī)制中的作用以及尋常型銀屑病血熱證的物質(zhì)基礎(chǔ)與辨證依據(jù)。方法 收集我院皮膚科門(mén)診尋常型銀屑病血熱證患者12例為觀(guān)察組，11例正常人為對(duì)照組。通過(guò)多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組外周血Thl7細(xì)胞活化相關(guān)因子HLA-DR、增殖因子Ki-67表達(dá)水平。結(jié)果 觀(guān)察組外周血Thl7細(xì)胞活化因子HLA-DR的表達(dá)及增殖因子Ki-67的表達(dá)均高于對(duì)照組（P<0.05）；但活化因子HLA-DR及增殖因子Ki-67與銀屑病的病情及嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分均無(wú)相關(guān)性（r1=-0.021，r2=0.098，均P>0.05）。結(jié)論 Th17細(xì)胞活化因子HLA-DR和增殖因子Ki-67在銀屑病血熱證患者外周血中表達(dá)上調(diào)，提示銀屑病血熱證患者外周血Th17細(xì)胞處于高活化狀態(tài)且增殖活躍，二者可能間接參與了銀屑病血熱證的發(fā)病過(guò)程，是銀屑病血熱證新的物質(zhì)基礎(chǔ)與辨證依據(jù)。

尋常型銀屑?。谎獰嶙C；Th17細(xì)胞；活化；增殖

近年來(lái)，銀屑病被認(rèn)為是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性炎癥性皮膚病，尤其是Th17細(xì)胞在本病的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制做了大量研究，但迄今其病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確。中醫(yī)學(xué)多認(rèn)為急性期銀屑病的主要病因是 “血分有熱”，從而確立血熱證的論治策略。本研究應(yīng)用多色流式細(xì)胞儀，對(duì)銀屑病血熱證患者外周血CD4+的Th17淋巴細(xì)胞活化相關(guān)標(biāo)志HLA-DR和增殖核蛋白Ki-67進(jìn)行檢測(cè)，研究銀屑病血熱證患者外周血是否存在Th17細(xì)胞活化和增殖，并與健康人進(jìn)行比較，為進(jìn)一步闡明銀屑病免疫發(fā)病機(jī)制和銀屑病血熱證物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照 《臨床皮膚病學(xué)》[1]，皮損為紅色的丘疹、斑疹，可融合成片，邊緣明顯，上覆多層銀白色鱗屑，將鱗屑刮去后有發(fā)亮薄膜，再刮除薄屑有點(diǎn)狀出血現(xiàn)象 (稱(chēng)為薄膜現(xiàn)象和點(diǎn)狀出血現(xiàn)象，即Auspitz征)。所有病例均有典型皮損并經(jīng)組織病理證實(shí)。

1.1.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 銀屑病血熱證的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)皮膚科病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]，其主癥包括新皮損不斷出現(xiàn)，以丘疹、斑丘疹為主，皮損基底皮膚顏色鮮紅，刮去鱗屑有點(diǎn)狀出血，有同形反應(yīng)；次癥包括初發(fā)或復(fù)發(fā)，可有不同程度的瘙癢、心煩、口渴或口干、便秘、尿黃、舌質(zhì)紅、苔黃、脈數(shù)，具備以上主癥及次癥2項(xiàng)以上者即可診斷。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合西醫(yī)尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）符合銀屑病血熱證的辨證標(biāo)準(zhǔn)；（3）年齡在18～65歲，無(wú)家族史，男女不限；（4）3個(gè)月內(nèi)無(wú)系統(tǒng)應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素或維甲酸類(lèi)藥物治療史，近2周內(nèi)無(wú)外用藥物史；（5）身心健康，無(wú)其他內(nèi)科疾病，血尿便常規(guī)、肝腎功能及其他生化指標(biāo)正常；（6）簽署知情同意書(shū)。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）關(guān)節(jié)型、膿皰型、紅皮病型銀屑病；（2）妊娠、孕婦、哺乳期患者；（3）有嚴(yán)重心、肝、腎疾患，糖尿病、高血壓、高血脂、惡性腫瘤等系統(tǒng)疾病患者；（4）既往有病毒性肝炎等傳染病病史。

1.2 一般資料

收集2013年12月至2014年3月我院皮膚科門(mén)診診斷為尋常型銀屑病血熱證患者12例 （觀(guān)察組），其中男6例，女6例；年齡18～47歲，平均(30.58±9.74)歲；病程2～38.5年，平均 13.07年；皮損面積5.5%～82%，平均31.2%；銀屑病的病情及嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分6～38.9，平均14.53。正常人11例為對(duì)照組，其中男6例，女5例；年齡23～34歲，平均（28.36±3.78）歲。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 主要試劑與儀器 APC-H7-CD3，BV421-CD4，PE-Cy7-CD56，F(xiàn)ITC-HLA-DR，PE-TCR-γδ均購(gòu)自BD公司；BV570-CD8(購(gòu)自BioLegend公司)；PerCP-Cyanine5.5-IL-17A，F(xiàn)ITC-Ki-67，APCRORgammat，F(xiàn)ITC-MOUSE-IgG2a均購(gòu)自 eBioscience公司；PMA(佛波脂)，Ionomycin(離子霉素)，Brefeldin-A(BFA，布雷菲德霉素A)均為Sigma公司產(chǎn)品；SEries 8000DH CO2Incubator（Thermo scientific公司），GALLIOS流式細(xì)胞儀（BECKMAN COULTER公司）。

1.3.2 外周血標(biāo)本采集與處理 于無(wú)菌狀態(tài)下采集尋常型銀屑病血熱證患者與健康志愿者清晨空腹靜脈血2 mL，用肝素鈉抗凝管，標(biāo)本的處理在4 h之內(nèi)完成。

1.3.3 外周血細(xì)胞的體外培養(yǎng)刺激 刺激：在流式管中加入500 μL全血+500 μL預(yù)先配好的1640培養(yǎng)液、PMA工作液 （100 ng/mL）、Ionomycin工作液（1 μg/mL）、BFA工作液 （10 μg/mL）。孵育：將加好培養(yǎng)液的標(biāo)本放置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育5 h，期間每隔1 h輕輕搖晃混勻1次。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞。

1.3.4 細(xì)胞染色 表面標(biāo)記的染色：在相應(yīng)的單陽(yáng)對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)的單個(gè)抗體 5 μL，Mouse-IgG、TCR-γδ和HLA-DR加量為10 μL，室溫避光孵育30 min。同型對(duì)照管中加入上述量的抗體MOUSEIgG2a、CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8，室溫避光孵育30 min。樣本管1中加入上述量抗體HLA-DR、CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8， 室溫避光孵育30 min。樣本管2中加入上述量抗體CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8，室溫避光孵育30 min。破膜：在單陽(yáng)對(duì)照管HLA-DR、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8、CD56中各加入1X破膜液1 mL，混勻，室溫避光放置30 min。所有管加入2 mL buffer，振動(dòng)混勻1 300 r／min，4℃，離心 5 min，去上清后再加入2 mL buffer，1 300 r／min，4℃，離心5 min，去上清。核內(nèi)染色：在1、2單陽(yáng)對(duì)照管中加入IL-17A和RORC2對(duì)應(yīng)抗體各5 μL，室溫避光孵育30 min。樣本管1中加入抗體IL-17A和RORC2；樣本2管中加入IL-17A和RORC2，Ki-67；30 min避光孵育后，各管加2 mL的buffer洗滌，1 300 r／min，4℃，離心5 min。去上清，加200 μL PBS懸浮細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測(cè)。用Gallios軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組Th17細(xì)胞免疫活化分子HLA-DR表達(dá)及增殖相關(guān)分子Ki-67表達(dá)的比較

觀(guān)察組Th17細(xì)胞表面活化標(biāo)記物HLA-DR的表達(dá)率及增殖標(biāo)記物Ki-67表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 Th17細(xì)胞免疫活化分子HLA-DR表達(dá)及增殖相關(guān)分子Ki-67表達(dá)的比較 （±s，%）

表1 Th17細(xì)胞免疫活化分子HLA-DR表達(dá)及增殖相關(guān)分子Ki-67表達(dá)的比較 （±s，%）

注：與對(duì)照組比較△P<0.05。

組別對(duì)照組觀(guān)察組例數(shù)11 12 HLA-DR Ki-67 8.016±2.334 5.665±2.251 11.686±4.799△ 8.727±3.854△

2.2 觀(guān)察組外周血Th17細(xì)胞活化狀態(tài)及增殖程度與PASI評(píng)分的相關(guān)性

通過(guò)Spearman和Kendall相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)，提示Th17細(xì)胞活化狀態(tài)及增殖程度與PASI評(píng)分均無(wú)相關(guān)性（r1=-0.021，r2=0.098，均P>0.05）。

3 討論

銀屑病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前認(rèn)為是T細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用所致，由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子刺激表皮增殖，而增殖角質(zhì)形成細(xì)胞又釋放其他細(xì)胞因子增強(qiáng)活化T細(xì)胞作用，形成T細(xì)胞介導(dǎo)的惡性循環(huán)。可見(jiàn)，活化的T細(xì)胞是銀屑病發(fā)病機(jī)制中的主要調(diào)節(jié)因子[3]。組織病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和混合T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[4-5]。T淋巴細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞，以其特征性的分泌IL-17而命名。由于其在銀屑病等自身免疫性疾病中的免疫調(diào)節(jié)和致病性作用，已受到皮膚病等相關(guān)研究領(lǐng)域極大的關(guān)注。研究表明，Th17細(xì)胞參與了銀屑病的發(fā)病[6-7]，其受到外來(lái)抗原刺激后，活化分泌一系列炎癥性細(xì)胞因子，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和皮膚炎癥。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為銀屑病多是以 “血分有熱”為主要病機(jī)特點(diǎn)，血熱、血瘀、血燥證為其基本證候[8-9]，雖然在銀屑病證候的研究中，學(xué)者們?cè)噲D通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)揭示其微觀(guān)實(shí)質(zhì)，但仍處于探索中。本研究中，我們選擇了T細(xì)胞中晚期免疫活化分子HLA-DR和增殖相關(guān)核蛋白Ki-67作為研究Th17細(xì)胞活化和增殖的觀(guān)察指標(biāo)，初步探討其在銀屑病血熱證中的作用及與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，為銀屑病血熱證提供新的物質(zhì)基礎(chǔ)和辨證依據(jù)。

正常情況下單核細(xì)胞高表達(dá)Ⅱ類(lèi)主要組織相容性(MHC)抗原HLA-DR。HLA-DR是單核巨噬細(xì)胞提呈外來(lái)抗原最重要的分子，在活化特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用。CD4+T淋巴細(xì)胞通過(guò)其表面的TCR識(shí)別單核巨噬細(xì)胞表面HLA-DR分子與外來(lái)抗原肽形成的復(fù)合物，與之結(jié)合后提供第一刺激信號(hào)而啟動(dòng)T細(xì)胞活化增殖及特異性免疫應(yīng)答。因此，單核細(xì)胞表面HLA-DR的表達(dá)和機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，也是銀屑病發(fā)病機(jī)制的一個(gè)潛在因素。Ki67是增殖細(xì)胞表達(dá)的一種核抗原，最早是在增殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，參與細(xì)胞的有絲分裂，是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，也是目前眾所周知的核增殖標(biāo)志物。關(guān)于Ki-67的研究，目前從文獻(xiàn)來(lái)看大多集中在腫瘤等增殖性疾病中，銀屑病的表皮過(guò)度增殖伴角化不全，與細(xì)胞增殖和凋亡，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂有關(guān)系。Ki-67在此方面的研究相對(duì)較少，基于上述認(rèn)識(shí)，本課題研究小組嘗試從Th17細(xì)胞的活化和增殖角度研究銀屑病血熱證的免疫發(fā)病機(jī)制。

由于Th17細(xì)胞沒(méi)有特異性的標(biāo)志，其主要分泌IL-17外，其他諸如NK，iNK，γδT等細(xì)胞也表達(dá)IL-17[10-11]，RORC2是其特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于標(biāo)記Th17細(xì)胞具有重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)中，分別標(biāo)記了這些細(xì)胞的表面標(biāo)記，從而從多個(gè)產(chǎn)IL-17的T淋巴細(xì)胞中篩選出Th17細(xì)胞，進(jìn)一步研究其活化狀態(tài)和增殖程度。研究結(jié)果表明，血熱證銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞表面活化相關(guān)分子HLADR和核內(nèi)增殖蛋白Ki-67的表達(dá)均高于正常對(duì)照，說(shuō)明血熱證銀屑病患者外周血中Th17細(xì)胞處于高活化狀態(tài)，且增殖活躍，提示HLA-DR和Ki-67在銀屑病血熱證中具有重要作用，可能促使Th17細(xì)胞分泌下游的促炎癥效應(yīng)細(xì)胞因子 IL-17A、IL-17F、IL-21等，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的有絲分裂，并能促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期過(guò)渡，導(dǎo)致具有相同抗原特異性的細(xì)胞克隆擴(kuò)增，大大增強(qiáng)了對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答，引起機(jī)體的免疫損傷，或通過(guò)免疫炎癥通路誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，從而表現(xiàn)為角化亢進(jìn)。有學(xué)者通過(guò)免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR方法）研究銀屑病患者皮損中Ki-67的分布和Ki-67mRNA的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)在基底細(xì)胞層和棘細(xì)胞層，且陽(yáng)性率高于正常對(duì)照組，Ki-67mRNA的表達(dá)也顯著高于正常表皮[12]，且Ki-67的表達(dá)與PASI呈正相關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分與上述研究類(lèi)似，但未發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞的免疫活化分子HLA-DR和增殖蛋白Ki-67的表達(dá)與PASI呈相關(guān)性，可能與本研究樣本量小，采血時(shí)間有關(guān)，和或在銀屑病外周血和皮膚中，Ki-67的表達(dá)是否具有一致性有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

本研究的意義在于利用多色流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析銀屑病血熱證患者外周血Th17細(xì)胞的活化和增殖狀態(tài)，其中也檢測(cè)了抑制性T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞的活化與增殖，以進(jìn)行不同產(chǎn)IL-17的T淋巴細(xì)胞的活化與增殖比較分析，數(shù)據(jù)未能在此顯示。本研究給銀屑病血熱證的免疫發(fā)病機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的理論依據(jù)和思路，同時(shí)對(duì)于銀屑病血熱證循環(huán)中活化和增殖的Th17細(xì)胞的理解，也將有助于銀屑病的免疫調(diào)節(jié)治療。

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（本文編輯 馬 薇）

The Expression of Th17 Cells Activation and Proliferation Related Factors in Peripheral Blood of Patients with Blood-heat Syndrome of Psoriasis Vulgaris

TIAN Haigang1,WU Hounan2,WANG Jianfeng1,GUO Fuyun1,HUANG Binbin1,YANG Xufang3, MIAO Chaoyang4,ZHANG Xiaoyan5*
（1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Cell Analytical Laboratory, Peking University Health Science Center,Beijing 100083,China;3.Inner Mongolia Medical University, Hohhot,Neimenggu 010110,China;4.Peking University Health Science Center,Beijing 100083, China;5.Department of Dermatology,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China）

Objective To explore the role of Th17 cell activation and proliferation relatedfactors in the pathogenesis of psoriasis vulgaris of blood-heat syndrome and material foundation as well as dialectical basis of blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris.Methods 12 patients with blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris were enrolled from our hospital dermatology clinic, and 11 cases of healthy individuals as normal control.The expression level of Thl7 cells activation related factor HLA-DR,proliferation factor Ki-67 in peripheral blood of patients with blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris and healthy subjects were examined by multicolor flow cytometry.Results Thelevel of Thl7 cells activated factor HLA-DR in peripheral blood of patients was high expression compared with control group (11.686%±4.799%vs 8.016%±2.334%, P<0.05),the expression of proliferation factor Ki-67 was also increased compared to control group (8.727%±3.854%vs 5.665%±2.251%,P<0.05).But the activation factor HLA-DR,proliferation factor Ki-67 and psoriasis area and severity index(PASI)score did not show correlations(r1=0.021, r2=0.098,P>0.05).Conclusion The high expression of Th17 cell activation factor HLA-DR and proliferation factor Ki-67 in peripheral blood of patients with psoriasis of blood-heat syndrome, indicates theperipheral blood of patients with psoriasis of blood-heat syndrome-Th17 cells were at a high state of activation and proliferation.Both HLA-DR and Ki-67 may indirectly involved in the pathogenesis process of psoriasis of blood-heat syndrome.They are probably novel material foundations and dialectical basis of blood-heat syndrome of psoriasis.

psoriasis vulgaris;blood-heat syndrome;Th17cell;activation;proliferation

R758.63

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.010.039.05

2014－04－11

國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（81171502）。

田海剛，男，醫(yī)學(xué)博士,主要從事中醫(yī)藥治療銀屑病療效機(jī)制研究。

*張曉艷，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，zhangxiaoyan2@medmail.com.cn。