短密木霉、咪唑乙煙酸和種植大豆對(duì)土壤真菌多樣性及農(nóng)藥殘留的影響1)

李志國(guó) 霍璐陽(yáng) 劉宇彤 劉晴 董愛(ài)榮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

當(dāng)今社會(huì)，農(nóng)藥在農(nóng)田耕作中起著十分重要的作用，但是農(nóng)藥的施加會(huì)產(chǎn)生一定量的農(nóng)藥殘留，對(duì)農(nóng)作物造成一定的影響，這一問(wèn)題已經(jīng)引起社會(huì)的高度重視[1]。所以，近年來(lái)利用微生物降解除草劑、殺蟲(chóng)劑等農(nóng)藥的研究得到了科學(xué)界的關(guān)注，并且也分離出一些高效降解菌[2-5]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，除草劑被廣泛地應(yīng)用[6]，其中咪唑乙煙酸活性高、用量低、選擇性廣等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)市場(chǎng)中占有重要的地位[7]，但由于咪唑乙煙酸在土壤中殘留時(shí)間長(zhǎng)，易對(duì)后茬作物玉米、蔬菜、棉花、高粱、油菜、甜菜、馬鈴薯等造成藥害[8]。微生物降解是除草劑主要的降解途徑[9]，微生物不僅對(duì)土壤中咪唑乙煙酸具有降解作用，同時(shí)對(duì)土壤中的微生物的數(shù)量、種類(lèi)也具有顯著的影響。本研究將1株對(duì)咪唑乙煙酸有高效降解作用的菌株施加在土壤中，定期測(cè)定土壤中的農(nóng)藥殘留量、真菌數(shù)量及種類(lèi)的變化。土壤真菌多樣性與短密木霉、咪唑乙煙酸、大豆之間存在著相互關(guān)系，研究試驗(yàn)前后土壤真菌多樣性的變化，對(duì)于深入理解修復(fù)對(duì)土壤真菌的影響作用機(jī)制具有較重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

盆栽模擬試驗(yàn)土壤為m(草炭)∶m(沙子)∶m(土)=5∶3∶2的比例進(jìn)行混合所得。大豆品種是黑農(nóng)48，菌種是試驗(yàn)前期馴化得到的高效降解菌株短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基采用孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20.0 g、1/3 000孟加拉紅溶液100 mL、蒸餾水1 000 mL、氯霉素0.1 g。

保存菌株采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 盆栽模擬試驗(yàn)

將短密木霉接種于60個(gè)PDA平板中，放入培養(yǎng)箱，25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d。待菌株大量產(chǎn)孢后，將菌絲連同孢子刮下，加入到盛有無(wú)菌水的燒杯中，放入少量的吐溫80，用玻璃棒充分的攪拌，均勻地混入部分試驗(yàn)用土壤中。

將部分試驗(yàn)用土壤加入不等量的5%咪唑乙煙酸水劑，分別制成咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50、100、150 mg/kg的污染土。

選擇籽粒飽滿(mǎn)、均勻、無(wú)病蟲(chóng)的大豆種子，每盆擺15粒，覆土2.0 cm，放在盆栽?xún)?nèi)自然生長(zhǎng)。

按表1設(shè)計(jì)盆栽試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，種植于東北林業(yè)大學(xué)溫室大棚中。盆栽處理后第5天、第10天、第20天、第30天、第40天分別用五點(diǎn)法取土樣，風(fēng)干，過(guò)10目篩，放入冰箱4 ℃保存待用。

表1 盆栽模擬試驗(yàn)處理組合

1.2.2 土壤真菌的分離、純化及計(jì)數(shù)

取處理5、10、20、30、40 d的土樣，分別稱(chēng)取5.0 g干土放入45 mL無(wú)菌水中，稀釋10倍，室溫下160 r/min搖床中振蕩20 min。取1 mL的土壤懸濁液加入到盛有9 mL無(wú)菌水的無(wú)菌試管中，反復(fù)吸打，稀釋到102倍，循環(huán)操作至103倍。分別吸取103的稀釋液40 μL移到孟加拉紅平板中，用涂布器涂抹均勻，用封口膜封口，培養(yǎng)箱里25 ℃培養(yǎng)。樣品設(shè)5個(gè)重復(fù)。根據(jù)培養(yǎng)后真菌的菌落形態(tài)特征(菌落顏色、大小、厚度、致密程度以及質(zhì)地等)進(jìn)行比較區(qū)分編號(hào)，將所有形態(tài)不同的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并分別轉(zhuǎn)接到試管斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)后置冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

每克干土中真菌數(shù)量=(菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù))/干土質(zhì)量；同時(shí)計(jì)算短密木霉的數(shù)量比例，短密木霉的數(shù)量比例=(短密木霉的數(shù)量/總真菌數(shù))×100%。

1.2.3 土壤真菌的鑒定

純化培養(yǎng)分離獲得的每個(gè)真菌菌落，純化后在顯微鏡下觀(guān)察菌絲體和子實(shí)體等結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征。對(duì)不產(chǎn)生子實(shí)體的菌落進(jìn)行光照、黑暗交替或低溫處理，誘發(fā)其產(chǎn)生休眠體或繁殖結(jié)構(gòu)。根據(jù)形態(tài)特征將真菌鑒定到種[10-12]。

1.2.4 土壤中農(nóng)藥殘留的測(cè)定

取5.0 g土加入到V(甲醇)∶V(碳酸鈉水溶液)=1∶1的混合溶液中，用漩渦振蕩器震蕩1 min，3 750 r·min-1離心10 min，取上清液2 mL，加入無(wú)水硫酸鈉、活性炭以及300 μL鹽酸。震蕩1 min，5 000 r·min-1離心5 min，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，待HPLC檢測(cè)。

以Agilent ZORBAX Extend-C18柱作為分離分析柱，流動(dòng)相為V(0.05%冰乙酸乙腈)∶V(0.4%冰乙酸水溶液)=40∶60，柱流速1.0 mL·min-1，柱溫室溫，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，保留時(shí)間6.2 min[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 短密木霉、大豆和咪唑乙煙酸對(duì)土壤真菌多樣性的影響

由表2得知，在培養(yǎng)期間，對(duì)照組(CK)的真菌數(shù)量逐漸增多，在20 d真菌數(shù)量最多，其后有所降低，這可能與當(dāng)時(shí)試驗(yàn)期間的溫度變化有關(guān)。在培養(yǎng)期間，真菌的種類(lèi)無(wú)明顯變化。A1與CK的真菌數(shù)量、種類(lèi)均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明大豆根系對(duì)真菌的數(shù)量、種類(lèi)影響不明顯。A2與CK的真菌數(shù)量、種類(lèi)差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明加入短密木霉后，對(duì)其他真菌具有抑制的作用，且短密木霉的數(shù)量在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)逐漸增多，20 d達(dá)到最高。A3、A4、A5與CK的真菌數(shù)量具有顯著性差異(P<0.05)，0～20 d真菌數(shù)量明顯減少，農(nóng)藥濃度越高，真菌的數(shù)量越少，30 d后真菌的數(shù)量逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。A3、A4、A5農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)種類(lèi)影響不大。A6、A7、A8與CK的真菌數(shù)量、種類(lèi)具有顯著差異(P<0.05)，真菌數(shù)量明顯增加，真菌種類(lèi)明顯減少。

2.2 土壤真菌的鑒定結(jié)果

采用稀釋平板法對(duì)土壤樣品進(jìn)行真菌分離。根據(jù)菌落形態(tài)，初步純化得到35個(gè)不同真菌菌株，鑒定出13屬20種，包括鏈格孢菌(Alternariasp.)、枝頂孢菌(Acremoniumsp.)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(A.niger)、曲霉菌(A. sp.)、螺卷毛殼(Chaetomiumcochliodes)、毛殼菌(Ch. sp.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)、粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)、腐質(zhì)霉菌(HumicoLasp.)、被孢霉菌(Mortierellasp.)、毛霉菌(Mucorsp.)、擬青霉菌(PaeciLomycessp.)、變灰青霉(Penicilliumcanescens)、黑青霉(P.nigricans)、青霉菌(P. sp.)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、短密木霉、木霉菌(T. sp.)。其中，曲霉屬、毛霉屬、青霉屬、木霉屬真菌是土壤中常見(jiàn)的真菌，占真菌總數(shù)的61.5%。加入短密木霉后，曲霉屬、青霉屬、毛霉屬真菌等土壤中常見(jiàn)的真菌雖然能從土壤中分離純化出來(lái)，但數(shù)量明顯減少，說(shuō)明短密木霉對(duì)其他真菌有抑制作用。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)土壤中真菌的數(shù)量

注：表中真菌數(shù)量數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 短密木霉、大豆和咪唑乙煙酸對(duì)咪唑乙煙酸降解的影響

由表3可知，A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11處理組土壤中的咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著處理時(shí)間的增加都逐漸的減少，10～20 d降解效率最高。A3、A4、A5處理組咪唑乙煙酸降解速度明顯低于A6、A7、A8、A9、A10、A11處理組。加入高效降解菌短密木霉后，咪唑乙煙酸降解速度明顯增加，說(shuō)明其能發(fā)揮較好的降解作用。種植大豆后，10 d前，A6、A7、A8處理組與A9、A10、A11處理組降解率無(wú)明顯差異，說(shuō)明生長(zhǎng)初期大豆吸附降解能力很弱；10 d后，前者略高于后者，說(shuō)明大豆對(duì)咪唑乙煙酸具有一定的吸附降解能力。此外，咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也會(huì)影響自身的降解，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，對(duì)土壤微生物、大豆影響越大，降解速度降低。

表3 不同試驗(yàn)組對(duì)咪唑乙煙酸的降解率

3 結(jié)論與討論

盆栽模擬試驗(yàn)結(jié)果表明，大豆對(duì)土壤真菌數(shù)量及種類(lèi)影響不明顯，短密木霉能抑制其他土壤真菌，培養(yǎng)期間真菌數(shù)量逐漸增多，20 d達(dá)到最高。咪唑乙煙酸對(duì)土壤真菌種類(lèi)、數(shù)量明顯抑制，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，真菌數(shù)量越少，20 d后真菌數(shù)量恢復(fù)到對(duì)照水平，試驗(yàn)組的農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)種類(lèi)影響不大。三者互作與對(duì)照組的真菌數(shù)量、種類(lèi)具有顯著性差異，真菌數(shù)量明顯增加，而種類(lèi)明顯減少。

土壤中的咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著處理時(shí)間增加都逐漸的減少，10～20 d降解效率最高。短密木霉、大豆和咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都會(huì)影響咪唑乙煙酸的降解。

本研究表明，大豆單獨(dú)對(duì)真菌數(shù)量的影響不顯著，該結(jié)果與於麗華等[14]報(bào)道的大豆根系明顯促進(jìn)土壤細(xì)菌數(shù)量的增長(zhǎng)，但對(duì)真菌數(shù)量的影響不明顯的結(jié)果基本一致。石兆勇等研究表明，高濃度農(nóng)藥會(huì)降低真菌的數(shù)量[15]，這與本研究基本一致。在本研究中，短密木霉、大豆、咪唑乙煙酸三者互作對(duì)真菌數(shù)量、種類(lèi)的影響也比較明顯，大豆對(duì)真菌影響不顯著，短密木霉與咪唑乙煙酸對(duì)其他真菌都起到了抑制的作用，而短密木霉具有降解農(nóng)藥的作用。

[1] 鄭永權(quán).農(nóng)藥殘留研究進(jìn)展與展望[J].植物保護(hù),2013,39(5):90-98.

[2] 楊明偉，葉非.微生物降解農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)，2010，36(3)：26-29,57.

[4] 臧海蓮，熊明華，成小松,等.一株咪唑乙煙酸的降解菌的分離鑒定及其降解特性[J].作物雜志，2010(3):40-44.

[5] 丁偉,白鶴,程茁,等.咪唑乙煙酸降解菌的分離、鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(5):1359-1362.

[6] 陳海偉,張魯華,陳德富,等.除草劑及抗除草劑作物的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望[J].生物技術(shù)通報(bào),2012(10):35-40.

[7] 張昌朋，劉新剛，徐軍,等.咪唑乙煙酸對(duì)土壤微生物生態(tài)的影響[J].農(nóng)藥，2010，49(2)：117-119.

[8] 李新安，李廣領(lǐng)，謝蘭芬,等.咪唑乙煙酸殘留對(duì)后茬作物油菜生理指標(biāo)的影響[J].農(nóng)藥，2015，54(9)：671-673.

[9] 田發(fā)軍，吳艷兵,趙歡歡,等.土壤微生物降解咪唑啉酮類(lèi)除草劑研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43(7)：1-5

[10] DOMSCH K H， GAMS W， ANDERSON T H． Compendium of soil fungi[M]. 2nd ed. London: Academic Press，1980．

[11] VON GAMS W． Cephalosporíum-artíge schimmelpilze (hyphomycetes)[M]. Stuttgart: Baarn Press，1971．

[12] TSUNEO W． Soil and seed fungi[M]. 2nd ed. Tokyo: CRC Press，2002.

[13] 王以燕.農(nóng)藥原藥和制劑的分析方法:CIPAC L卷的分析方法[J].世界農(nóng)藥,2009,31(1):37-39.

[14] 於麗華，洛雪,殷博,等.甜菜、玉米和大豆根系對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響[J].中國(guó)甜菜糖業(yè)，2008(2):8-11.

[15] 石兆勇，王發(fā)園.農(nóng)藥污染對(duì)微生物多樣性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(19):5840-5841,5915.