復(fù)蘇周期囊胚移植后完全性葡萄胎與正常胎兒共存病例分析

邵淑敏，李姣，鄒敏，汪文諍，張玲

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心/計劃生育研究所，武漢 430030)

患者，女，31歲，因“女方繼發(fā)性不孕，男方梗阻性無精子癥，雙側(cè)輸精管缺如”在本生殖中心行ICSI-ET助孕治療。女方身高158 cm，體重62.6 kg，BMI 25.08 kg/m2，無不良嗜好，健康狀況良好，無既往病史，無家族病史。平素月經(jīng)規(guī)律，11歲，5～7 d/30～37 d，經(jīng)量中等，無痛經(jīng)。女方初婚足月產(chǎn)一子，現(xiàn)健在。2011年再婚后一直同居，有正常性生活，未避孕三年未孕，無流產(chǎn)和早產(chǎn)史。女方基礎(chǔ)內(nèi)分泌FSH 5.56 U/L、LH 2.98 U/L、E2102.76 pmol/L，竇卵泡計數(shù)(AFC)27 個，血型B/Rh陽性，染色體組型46,XX，其他檢查未見明顯異常。男方，28歲，一般體格檢查正常，無既往病史，無家族病史。生殖系統(tǒng)檢查睪丸體積正常，左右輸精管捫及不清，其他無異常。男方基礎(chǔ)內(nèi)分泌FSH 3.95 U/L、LH 3.69 U/L、E232.00 pmol/L、PRL 5 634.11 mU/L、T 10.96 nmol/L。多次精液常規(guī)檢查均未見精子，行雙側(cè)睪丸穿刺術(shù)可見精子，無任何不適癥狀。血型B/Rh陽性，染色體組型46，XY。

女方促排卵采用長方案，月經(jīng)周期第21天開始皮下注射GnRH-a(達(dá)菲林，輝凌，美國)0.1 mg/d，持續(xù)皮下注射14 d后，注射劑量調(diào)整為0.05 mg/d，持續(xù)皮下注射3 d后通過B超檢測達(dá)到降調(diào)效果，肌肉注射FSH(普麗康，默沙東，英國)200 U/d啟動Gn，啟動Gn后持續(xù)皮下注射GnRH-a 0.05 mg/d；Gn啟動第3 天開始B超檢測卵泡發(fā)育，Gn啟動第7 天，調(diào)整FSH的肌注量為100 U/d，并增加肌注75 U/d HMG(珠海麗珠)，Gn啟動第9 天，Gn總量為1 700 U，其中FSH 1 400 U、HMG 300 U，B超顯示獲得18～20 mm以上的優(yōu)勢卵泡5 個，血激素水平LH 2.46 U/L、E219 003.26 pmol/L、P 3.02 nmol/L，內(nèi)膜厚度9 mm，內(nèi)膜類型為A型，當(dāng)晚20：00點肌肉注射10 000 U HCG(珠海麗珠)，HCG肌肉注射后36～37 h在陰道B超引導(dǎo)下取卵，獲取23 個卵母細(xì)胞，并將卵母細(xì)胞置于受精培養(yǎng)液中(G-IVF PLUS，Vitrolife，美國)暫時培養(yǎng)。

男方于取卵日行睪丸穿刺術(shù)獲取精子，用20 ml注射器針頭抽吸睪丸組織，并置于盛有精子洗滌液(SpermRinse，Vitrolife，美國)的培養(yǎng)皿中，用針頭將組織撕碎，倒置顯微鏡下檢查有無精子，每高倍鏡視野下偶見精子，未見活動精子，精子形態(tài)正常。將撕碎的睪丸組織350g離心10 min，棄上清，在沉淀上加0.2 ml精子洗滌液(SpermRinse)，獲得的精子置于室溫下待用。卵母細(xì)胞暫時培養(yǎng)2 h后，用透明質(zhì)酸酶(Sigma，美國)消化法脫去卵周圍大部分顆粒細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞的成熟度。22 個MⅡ卵行ICSI，胚胎培養(yǎng)第1 天觀察受精情況，10 個正常受精卵(2PN)、4個異常受精卵(1PN)、8個未受精卵(0PN)；胚胎培養(yǎng)第3 天共獲得9 個優(yōu)質(zhì)胚胎，移植2 個胚胎(評分為8Ⅱ、8Ⅱ)，冷凍6 個卵裂期胚胎。正常受精剩余2 個和1PN來源4 個胚胎行囊胚培養(yǎng)，胚胎培養(yǎng)第6 天，2個1PN來源的卵裂期胚胎形成2 個優(yōu)質(zhì)囊胚行冷凍保存(評分為4CB、4CB)。胚胎移植術(shù)后常規(guī)用藥，胚胎移植術(shù)后14 d測定血清中尿β-HCG值為1.63 U/L，未妊娠。

2015年5月行人工周期凍融胚胎移植(FET-ET)，從月經(jīng)周期第2 天開始口服補(bǔ)佳樂(拜耳，德國)4 mg/d，月經(jīng)周期第12 天左側(cè)卵巢有1個0.8 cm×0.7 cm卵泡，內(nèi)膜厚度為5.5 mm，根據(jù)內(nèi)膜情況和血激素水平調(diào)整補(bǔ)佳樂劑量為6 mg/d，月經(jīng)周期第16 天調(diào)整補(bǔ)佳樂劑量為8 mg/d，并監(jiān)測LH峰，月經(jīng)周期第19天，補(bǔ)佳樂使用天數(shù)18天，總量96 mg，內(nèi)膜厚度為7 mm，肌肉注射黃體酮(珠海麗珠)40 mg進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第6天移植2 個4CB囊胚(1PN來源)。移植后肌肉注射黃體酮60 mg/d，補(bǔ)佳樂維持原劑量。移植后14 d測定β-HCG值為1 358 U/L。移植后28 d，B超顯示：宮內(nèi)單活胎早孕，囊內(nèi)可見卵黃囊，胚芽可探及和原始心管搏動血流信號；另可見一無回聲區(qū)，內(nèi)未見明顯卵黃囊，孕囊周邊可見非純液性暗區(qū)。移植后34 d，患者陰道間斷流血入院保胎治療，漸出現(xiàn)惡心、嘔吐，伴腹脹，并逐漸加劇。2015年7月復(fù)查三維彩超顯示：宮腔右側(cè)可見一成形胎兒，可見胎動及胎心搏動；宮腔左側(cè)可見12 cm×6.8 cm高回聲光團(tuán)，內(nèi)可見蜂窩狀大小不等的無回聲，邊界清晰，光團(tuán)周邊可見豐富的血流信號。超聲提示：單胎存活合并葡萄胎，卵巢黃素囊腫?；颊吒姑浖觿?，呼吸困難，血壓持續(xù)增高，轉(zhuǎn)入上級醫(yī)院治療。轉(zhuǎn)院后查血β-HCG>1×106U/L；B超：宮腔內(nèi)見一成形胎兒，可探及胎心；宮腔左側(cè)見不均勻增高區(qū)，內(nèi)在散在無回聲區(qū)，呈蜂窩狀。CT：兩側(cè)胸腔積液、縱隔內(nèi)，兩側(cè)腋窩多發(fā)淋巴結(jié)顯示。孕11+5周確診為宮內(nèi)早孕合并滋養(yǎng)層細(xì)胞疾病，并給予對癥治療，行葡萄胎負(fù)壓吸宮術(shù)+鉗刮術(shù)。病理組織提示：見滋養(yǎng)層細(xì)胞增生，絨毛間質(zhì)高度水腫，間質(zhì)內(nèi)無胎源性血管，為完全性葡萄胎。術(shù)后第2 天開始第1 個療程化療，連續(xù)化療4 個療程，術(shù)后2個月β-HCG降至正常，繼續(xù)鞏固化療3 個療程，至今未復(fù)發(fā)。

討 論

根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)分類，將葡萄胎分為部分性葡萄胎(PHM)和完全性葡萄胎(CHM)，PHM是由一個單倍體卵母細(xì)胞和兩個單倍體精子受精，或由一個單倍體卵母細(xì)胞和一個減數(shù)分裂缺陷的雙倍體精子受精而成，其染色體核型90%以上為三倍體，合并存在的胎兒也是三倍體，通常三倍體的胎兒在孕期前3 個月就不能存活。CHM是由一個細(xì)胞核缺如或失活的卵母細(xì)胞與一個單倍體精子受精，或有一個失活的卵母細(xì)胞分別和兩個單倍體精子同時受精而成，其染色體核型為二倍體，均為父本來源，不能形成胎兒[1]。在臨床上，完全性葡萄胎與胎兒共存(CHMCF)的發(fā)生率為1/22 000～1/1 000 000，其胎兒有可能繼續(xù)存活，但是易出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)前子癇等并發(fā)癥[2]，其真正的發(fā)病原因目前尚不清楚，促排卵或醫(yī)源性多胎是否造成CHMCF發(fā)病率增加，目前也尚無定論。

多篇文獻(xiàn)報道ART治療后發(fā)生妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病，均為個案報告，主要是集中在IVF/ICSI-ET后，可能與精子/卵母細(xì)胞異常、促排卵刺激、負(fù)壓抽吸取卵、胚胎質(zhì)量、技術(shù)操作、體外培養(yǎng)等因素有關(guān)[3]。個別文獻(xiàn)報道是使用促排藥之后，研究發(fā)現(xiàn)79%的多胎合并CHM患者曾服用促排卵藥物，這可能與促排卵藥物增加異常卵母細(xì)胞發(fā)生率有關(guān)[4]。在本病例中，移植的2 枚囊胚均來源于ICSI的1PN胚胎。ICSI受精是將單個精子注射入卵胞質(zhì)內(nèi)，受精16～18 h后，卵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)2 個原核(2PN)，并且卵周間隙內(nèi)有2 個極體，被認(rèn)為正常受精；但仍有一部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)1 個原核(1PN)和多個原核(≥3PN)，則被認(rèn)為是異常受精。ICSI的異常受精可能與卵母細(xì)胞質(zhì)量差、精子缺陷等有關(guān)；對于含有2個極體但只有1PN的合子，可能是極體碎片化造成的誤判，ICSI前對卵母細(xì)胞進(jìn)行脫顆粒細(xì)胞時就已經(jīng)形成了極體的碎片化，且這種卵母細(xì)胞受精后也不能形成雌原核或雄原核[5]。研究表明，IVF受精形成的1PN受精卵通常是二倍體的，且50%含有Y染色體[6]，1PN來源的囊胚仍可以保持足夠的維持妊娠率；但I(xiàn)CSI中1PN來源的囊胚則不能維持妊娠[7]。研究發(fā)現(xiàn)ICSI受精形成的1PN受精卵，僅有10%含有Y染色體，說明來源于ICSI受精的1PN合子可能不是精卵受精形成的，但其形成機(jī)制目前尚不清楚。有研究認(rèn)為可能是在細(xì)胞分裂中期，通過電融合細(xì)胞核的方式成為一個完整的合子，進(jìn)而形成一個單倍體胚胎，通常與延遲排卵和卵母細(xì)胞過熟等因素有關(guān)[6]。但也有研究持相反的理論，認(rèn)為來源于ICSI的1PN胚胎中有27.9%是具有雌原核和雄原核的二倍體的胚胎，ICSI受精后8～10 h可觀察到原核發(fā)育不同步的現(xiàn)象，認(rèn)為1PN合子是由于原核觀察時兩個雌、雄原核發(fā)育速度不同步或過早融合造成的。同時，ICSI中1PN合子形成的卵裂期胚胎的單倍體發(fā)生率明顯高于IVF(31.2% vs 3.1%)，且所有的卵裂球均只檢測到Y(jié)染色體，認(rèn)為雄原核激活、雌性基因組完全被排除與單原核形成有關(guān)[8]。但有研究則認(rèn)為ICSI的1PN合子的單個原核攜帶母源和父源的兩套基因組，是在受精過程中原核形成失調(diào)引起的[9]。

正常受精和異常受精卵裂形成的胚胎都可能存在染色體異常，尤其是異常受精的胚胎，非整倍體和嵌合體的發(fā)生率較高，胎兒畸形和葡萄胎的出現(xiàn)明顯增多[10]。ICSI來源的1PN胚胎存在染色體異常，約占70%[8]，也有研究指出ICSI來源的1PN胚胎均為染色體異常的胚胎，因此葡萄胎可能來源于ICSI的1PN胚胎。近年來有多個研究報道ICSI后發(fā)生葡萄胎妊娠的病例，與本病例相同的文獻(xiàn)報道指出移植2 個ICSI胚胎(2PN和1PN胚胎各1 個)后形成葡萄胎和正常胎兒共存，推斷1PN來源的異常受精胚胎是造成葡萄胎的原因，認(rèn)為移植1PN來源的胚胎有一定的風(fēng)險[11]。但有文獻(xiàn)報道移植3 個ICSI的2PN胚胎，也形成CHM和正常胎兒共存的雙胎妊娠，且遺傳分析發(fā)現(xiàn)CHM的基因組來源于一條單個精子的重復(fù)，二倍體精子受精或精子DNA核內(nèi)再復(fù)制是引起葡萄胎妊娠的原因[12-13]。在 ICSI胚胎形成的葡萄胎組織中，檢測到父源二倍體基因組，認(rèn)為可能是由于單倍體父源基因組再復(fù)制后和一個失活的卵母細(xì)胞受精，或者是二倍體精子和一個失活的卵母細(xì)胞受精造成的[14]。此外，移植ICSI后的第3天凍融胚胎也有形成PHM的病例報道。ICSI-ET后形成葡萄胎的染色體均為父源性，沒有母源性染色體，是精子DNA核內(nèi)再復(fù)制成二倍體或二倍體精子受精等引起的，因此ICSI技術(shù)的單個精子受精并不能完全防止葡萄胎妊娠的發(fā)生，ICSI技術(shù)操作的精子選擇或機(jī)械損傷對ART葡萄胎形成的潛在影響還需進(jìn)一步探討[15]。

來源于ICSI的1PN合子可能是受精過程中原核形成異常造成的，引起第一次有絲分裂和染色體分離異常，導(dǎo)致形成染色體異常的胚胎。ICSI來源的1PN胚胎染色體異常比例較高，染色體正常率僅約為25%。雖然文獻(xiàn)報道染色體異常比例結(jié)果不一致，但大部分研究認(rèn)為囊胚培養(yǎng)可篩選一部分較強(qiáng)發(fā)育潛能和染色體正常的胚胎，提高胚胎利用率和累積妊娠率。此外，1PN胚胎也有可能是原核發(fā)育不同步或過早融合造成的，若1PN卵裂期胚胎能形成囊胚，則可認(rèn)為其染色體正常的機(jī)率較高，可用于冷凍和移植。本例患者移植1PN囊胚后形成葡萄胎，相似臨床病例認(rèn)為1PN胚胎有可能與葡萄胎形成有關(guān)，75%的染色體異常的胚胎也能形成質(zhì)量較好的囊胚，囊胚培養(yǎng)并不能篩除染色體異常的胚胎，為提高輔助生殖技術(shù)的安全性，對于ICSI后形成的1PN胚胎應(yīng)予以廢棄[9]。同時，本文認(rèn)為IVF來源的1PN胚胎也不應(yīng)該作為首選的移植胚胎，若需移植1PN胚胎，可以通過植入前遺傳學(xué)篩查排除染色體異常后再行移植。