利用環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化合成AA-2G的研究

單麗媛 ， 劉 龍 ， 李江華 ， 堵國成 *， 陳 堅(jiān)

（1．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

維生素 C（VC），又名 L-抗壞血酸（L-AA），是人體無法合成但卻必需的營養(yǎng)元素[1]。在制藥、食品、化妝品等行業(yè)有重要應(yīng)用前景。由于VC很容易受到光照、熱、金屬離子等環(huán)境因素的影響而發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其本身化學(xué)結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定[2]。因此，尋找一種VC代替品能夠行使VC功能的同時(shí)提高其穩(wěn)定性具有重要意義。而2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸（AA-2G）作為VC的衍生物具有以下優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性強(qiáng)：AA-2G在水溶液中特別穩(wěn)定，能抵抗各種氧化條件。具有較高的耐熱性和抗氧化性[3-4]。安全性高：在各種VC糖基衍生物中，AA-2G沒有細(xì)胞毒性，安全性最佳，并且沒有直接還原性[5-7]。能保持VC的生物功能：在α-糖苷酶等酶的作用下AA-2G水解，逐步釋放維生素C和葡萄糖，有效保護(hù)維生素C的生物活性[8]。生物合成容易：AA-2G可以通過生物酶法轉(zhuǎn)化得到，操作過程簡單、易于控制、污染少[9]。

環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）屬于糖基水解酶家族，被認(rèn)為是催化合成AA-2G的最佳酶[10]。CGTase能夠催化4種反應(yīng)：水解反應(yīng)，環(huán)化反應(yīng)，耦合反應(yīng)以及歧化反應(yīng)[11]。CGTase通過歧化作用可以催化低聚糖和VC反應(yīng)生成葡萄糖基維生素C[12]。

目前，α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精在CGTase催化合成AA-2G的過程中憑借它們較高的轉(zhuǎn)化率，常被用作糖基供體[13]。張子臣[14]等利用β-環(huán)糊精作為糖基供體得到AA-2G的產(chǎn)量為9.76 g/L。日本林原生化和岡山大學(xué)[15]曾首次以α-環(huán)糊精作為糖基供體通過生物轉(zhuǎn)化法合成AA-2G，AA-2G的純度可達(dá)97%。Hong[13]等以環(huán)糊精為糖基供體利用從泡菜中獲得的CGT酶轉(zhuǎn)化合成AA-2G，最終得到AA-2G產(chǎn)量最高為2.98 g/L。但是，α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精這兩種糖基供體同時(shí)也存在如下缺陷：α-環(huán)糊精價(jià)格比較昂貴，以此作為糖基供體時(shí)，生產(chǎn)成本比較高；β-環(huán)糊精雖然價(jià)格比α-環(huán)糊精低一些，但是β-環(huán)糊精在水溶液中的溶解度較低，經(jīng)常以固體顆粒形式存在。所以，α-和β-環(huán)糊精均不具有大規(guī)模生產(chǎn)AA-2G的潛力[16]。因此，選擇一種價(jià)格低廉又易溶的底物，代替α-和β-環(huán)糊精作為CGTase催化生產(chǎn)AA-2G的糖基供體，將會(huì)大大降低生產(chǎn)成本。

韓瑞枝[16]等通過對(duì)CGT與淀粉酶碳水化合物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行融合表達(dá)，以可溶性淀粉為底物最終得到AA-2G的最高產(chǎn)量為3.03 g/L。作者通過幾種糖基供體的比較，選擇具有較大優(yōu)勢的可溶性淀粉作為糖基供體。可溶性淀粉具有溶解度高、價(jià)格低廉等優(yōu)勢，在轉(zhuǎn)化率、成本等各方面也都優(yōu)于其它糖基供體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶液來源 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGT-SL），酶活（α-環(huán)化活力）為476 U/mL：日本天野公司提供。1.1.2 主要試劑 VC：中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；麥芽糊精：山東西王食品有限公司產(chǎn)品；β-環(huán)糊精：Sigma-Aldrich（上海）公司產(chǎn)品；AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社（日本）產(chǎn)品；其它各種試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-環(huán)化活力的測定 采用甲基橙法測定α-環(huán)化活力[17]。具體步驟為：0.9 mL 3 g/dL的可溶性淀粉溶液在40℃下預(yù)先保溫10 min。將適當(dāng)稀釋的酶液 （對(duì)照用pH 6.0的磷酸緩沖液代替）0.1 mL加入到0.9 mL 3 g/dL的可溶性淀粉溶液中，在40℃下反應(yīng)10 min，之后加入1.0 mL 1.0 mol/L鹽酸停止反應(yīng)。然后再加入1.0 mL 0.1 mmol/L甲基橙溶液顯色，20℃條件下保溫20 min，最后在505 nm下測定樣品吸光度。一個(gè)酶活單位（U）定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol/L α-環(huán)糊精所需的酶量[18]。作者所述酶活均為α-環(huán)化活力。

1.2.2 AA-2G合成反應(yīng)的初始條件 反應(yīng)體系：CGT-SL酶液2 mL（酶液適當(dāng)稀釋，終濃度為47.6 U/mL），糖基供體 0.5 mL（終質(zhì)量濃度 10 g/L），維生素C 0.5 mL（終質(zhì)量濃度10 g/L）。反應(yīng)條件：初始pH 4.2，28℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，避光避氧條件下反應(yīng)24 h[19]。

1.2.3 反應(yīng)液樣品處理方法 將反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液樣品12 000 r/min離心10 min，然后用0.22 mm微孔過濾膜過濾。

1.2.4 AA-2G檢測方法 高效液相色譜法[20]。色譜柱：Amethyst C18-H；檢測器：Variable Wavelength Detector（UV）；檢測波長：240 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：V（KH2PO4）∶V（甲醇）=99.5∶0.5，用磷酸調(diào)pH至2.0。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的確定

為了對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行確定，對(duì)在初始反應(yīng)條件下得到的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進(jìn)行LC-MS鑒定。HPLC結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液樣品中在1.12 min出現(xiàn)峰 （圖1B）和AA-2G標(biāo)準(zhǔn)樣品出峰時(shí)間1.11 min（圖1A）基本一致，初步判斷為AA-2G。為了進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，對(duì)AA-2G標(biāo)準(zhǔn)樣品和轉(zhuǎn)化液樣品進(jìn)行MS鑒定。AA-2G的相對(duì)分子質(zhì)量為338.27。如圖1D，轉(zhuǎn)化反應(yīng)樣品 m/z=339.2（M+1）和 m/z=337.2（M-1），推斷其相對(duì)分子質(zhì)量為338.2，與標(biāo)準(zhǔn)樣品MS（圖1C）結(jié)果一致，可確定轉(zhuǎn)化液樣品中含有AA-2G。

圖1 AA-2G標(biāo)準(zhǔn)樣品及轉(zhuǎn)化反應(yīng)液LC-MS圖Fig.1 LC/MS result of the biotransformation product and standard sample of AA-2G

2.2 糖基供體種類對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響

CGT酶可以利用多種寡聚糖合成AA-2G。為了找到合適的糖基供體作為CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的底物，作者選取了6種不同的糖基供體來源：β-環(huán)糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精、蔗糖及葡萄糖。如圖2，該酶不能利用蔗糖和葡萄糖合成AA-2G。在初始反應(yīng)條件下，β-環(huán)糊精和可溶性淀粉作為糖基供體時(shí)AA-2G的產(chǎn)量分別為1.24 g/L和1.23 g/L，明顯優(yōu)于其他糖基供體。考慮到可溶性淀粉與β-環(huán)糊精相比具有可溶性強(qiáng)、便宜易得等優(yōu)點(diǎn)，作者選用可溶性淀粉作為糖基供體進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化研究。

2.3 酶濃度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響

酶濃度對(duì)AA-2G的產(chǎn)量有重要的影響。在初始反應(yīng)條件下，以可溶性淀粉為糖基供體，考察不同的酶濃度對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響。如圖3，隨著酶濃度的增加，AA-2G的產(chǎn)量隨之增加。當(dāng)酶濃度達(dá)到79 U/mL時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最高，達(dá)到3.53 g/L。當(dāng)酶濃度高于79 U/mL時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量逐漸降低。所以，選擇酶濃度為79 U/mL作為后續(xù)研究。

圖2 糖基供體對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響Fig.2 Effect of different glycosyl donors on AA-2G production

圖3 不同的加酶量對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響Fig.3 Influence of different enzyme concentrations on AA-2G production

2.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響

底物質(zhì)量濃度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G有重要影響。在酶濃度為79 U/mL，其它條件和初始反應(yīng)條件一致的情況下，考察不同的底物質(zhì)量濃度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響。如圖4，隨著底物質(zhì)量濃度的不斷增加，AA-2G的產(chǎn)量也隨之增加。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到16 g/L時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量達(dá)到最高4.36 g/L。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過16 g/L時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量反而有下降趨勢。所以選擇底物質(zhì)量濃度16 g/L進(jìn)行后續(xù)條件優(yōu)化研究。

圖4 底物濃度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on synthesis of AA-2G

2.5 底物VC與可溶性淀粉的比例對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響

VC與可溶性淀粉的比例不同對(duì)AA-2G的產(chǎn)量有不同的影響。采用酶濃度為79 U/mL，其它條件和初始反應(yīng)條件一致，考察VC與可溶性淀粉的質(zhì)量比對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響。如圖5，當(dāng)VC與可溶性淀粉的比例為2∶4時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最高達(dá)到0.826 g/L，VC轉(zhuǎn)化率為21.06%。當(dāng)VC與可溶性淀粉的質(zhì)量比為1∶5時(shí)，VC轉(zhuǎn)化率為25.08%，高于VC與可溶性淀粉的比例為2∶4時(shí)VC的轉(zhuǎn)化率。但AA-2G的產(chǎn)量只有0.48 g/L，較VC與可溶性淀粉的比例為2∶4低。所以，作者選擇VC與淀粉的質(zhì)量比為2∶4進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化研究。

2.6 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響

為了考察CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的最適反應(yīng)時(shí)間，選擇酶濃度為79 U/mL，VC質(zhì)量濃度為16 g/L，VC和淀粉的質(zhì)量比為2∶4，轉(zhuǎn)化溫度為25℃進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)間優(yōu)化。反應(yīng)過程中分別在不同的時(shí)間取樣檢測AA-2G的含量。如圖6，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長，AA-2G的產(chǎn)量隨之增加。當(dāng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為32 h時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量達(dá)到最高，為4.66 g/L。對(duì)應(yīng)VC轉(zhuǎn)化率為14.90%。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過32 h時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量反而略有下降。所以，作者選擇轉(zhuǎn)化時(shí)間為32 h進(jìn)行后續(xù)研究。

圖5 VC與可溶性淀粉的比例對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響Fig.5 Effect of substrate proportion on the synthesis of AA-2G

圖6 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間對(duì)CGT-SL合成AA-2G的影響Fig.6 Effect of time on AA-2G synthesis

2.7 溫度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響

反應(yīng)溫度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G具有重要影響。選擇酶濃度為79 U/mL，VC質(zhì)量濃度為16 g/L，VC和淀粉的質(zhì)量比為2∶4，反應(yīng)時(shí)間為32 h進(jìn)行轉(zhuǎn)化溫度優(yōu)化。作者選取8個(gè)不同的溫度，考察溫度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響。如圖7，當(dāng)反應(yīng)溫度為15℃時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量為5.953 g/L，明顯高于其它溫度下的產(chǎn)量，VC轉(zhuǎn)化率為19.05%。當(dāng)溫度低于或高于15℃時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量明顯下降。所以，作者選擇轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為15℃。

圖7 溫度對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響Fig.7 Effect of temperature on AA-2G synthesis

2.8 反應(yīng)初始pH對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響

不同的反應(yīng)初始pH對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G具有不同的影響，pH過高或過低都可能會(huì)造成CGT-SL酶活力損失甚至喪失，進(jìn)而在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中導(dǎo)致AA-2G的產(chǎn)量下降甚至完全沒有。選擇酶濃度為79 U/mL，VC質(zhì)量濃度為16 g/L，VC和淀粉的質(zhì)量比為2∶4，溫度為15℃，反應(yīng)時(shí)間為32 h，改變初始 pH （2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）， 考察不同 pH 對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G產(chǎn)量的影響。由圖8可以看出，初始pH為4.0時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最高，達(dá)到6.23 g/L，VC轉(zhuǎn)化率為19.93%。當(dāng)初始pH低于或高于4.0時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量有所下降。當(dāng)初始pH超過6.0時(shí)，不再有AA-2G生成，可能是CGT-SL在超過pH 6.0的條件下已經(jīng)完全失去活力。所以，選擇最佳pH 4.0進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

圖8 pH對(duì)CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的影響Fig.8 Effect of pH on AA-2G synthesis

2.9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取單因素優(yōu)化中影響相對(duì)較大的因素：酶濃度、底物（VC）濃度、pH、溫度 4個(gè)因素，以 AA-2G的產(chǎn)量為指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，各水平因素見表1。

設(shè)計(jì)9組試驗(yàn)，各組試驗(yàn)結(jié)果及方差分析表見表2。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，最佳組合為：酶濃度79 U/mL，底物 VC為 14 g/L，pH 4.0，反應(yīng)溫度 20℃，得到AA-2G產(chǎn)量為6.20 g/L，與單因素組合優(yōu)化的產(chǎn)量相比相差不大。

表1 各因素水平表Table 1 Level of various factors

表2 AA-2G產(chǎn)量正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test and the production of AA-2G

3 結(jié) 語

作者利用日本田野公司提供的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGT-SL），通過幾種不同的糖基供體（β-環(huán)糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精、蔗糖及葡萄糖）比較研究，發(fā)現(xiàn)其不能利用葡萄糖和蔗糖。在初始反應(yīng)條件下，β-環(huán)糊精和可溶性淀粉作為糖基供體，AA-2G的產(chǎn)量分別為1.24 g/L和1.23 g/L。相比于其他糖基供體具有較大優(yōu)勢。從節(jié)約成本、糖基供體的溶解度和產(chǎn)量方面考慮，作者最終選擇可溶性淀粉作為糖基供體。以可溶性淀粉和VC為底物轉(zhuǎn)化合成AA-2G，產(chǎn)物通過HPLC/LC-MS分析，確定了轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中含有AA-2G。在初始反應(yīng)條件下，CGT-SL利用可溶性淀粉和VC轉(zhuǎn)化合成AA-2G的產(chǎn)量為1.23 g/L。通過轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化確定了CGT-SL轉(zhuǎn)化合成AA-2G的最佳反應(yīng)條件：酶濃度為79 U/mL，VC質(zhì)量濃度為16 g/L，底物VC和可溶性淀粉的質(zhì)量比為2∶4，最適溫度15℃，最適pH 4.0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間32 h，最終AA-2G的產(chǎn)量達(dá)到6.23 g/L，VC轉(zhuǎn)化率為19.93%。與初始條件下相比，AA-2G的產(chǎn)量提高了4.06倍。

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