慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾沉默RRS1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7生物學(xué)行為的影響

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，山東 青島 266021)

乳腺癌發(fā)病率逐年提高[1]，并呈年輕化發(fā)展的趨勢[2]，占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位，其死亡率居惡性腫瘤死亡率的第二位[3]。其治療手段主要包括手術(shù)治療、放化療及內(nèi)分泌治療等。但是，乳腺癌病因多種多樣，如膳食方面，高碳水化合物、高脂肪、高蛋白飲食是乳腺癌發(fā)病的高危因素，蔬菜水果等富含膳食纖維和維生素的食物是乳腺癌很好的保護(hù)因素[4-10]；適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動也會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。近年來，乳腺癌內(nèi)科治療中的基因靶向治療成為臨床研究的熱點(diǎn)[11]。但乳腺癌相關(guān)生物標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)研究尚不足，需要進(jìn)一步對相關(guān)因子進(jìn)行探討。本研究根據(jù)乳腺癌成對樣本信息，通過高通量差異表達(dá)基因篩選和生物信息分析，成功篩選出一個新的對乳腺癌有重要作用的基因——核糖體合成調(diào)控因子RRS1(Regulator of Ribosome Synthesis 1)基因。為了解分析RRS1在乳腺癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾MCF-7細(xì)胞中RRS1基因的表達(dá)，探討此基因?qū)CF-7細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及周期的影響，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HMEC細(xì)胞(上海吉尼歐公司)，MCF-7細(xì)胞(青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)，胰蛋白酶-EDTA(0.53 mmol/L)消化液、RIPA蛋白提取試劑盒、DMSO、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、MTT及PI試劑(北京索萊寶生物科技有限公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，慢病毒轉(zhuǎn)染載體和轉(zhuǎn)染試劑盒(上海吉凱基因公司)，RRS1、β-Actin引物(上海生工生物工程有限公司)，小鼠抗人RRS1單克隆抗體以及小鼠抗人β-Actin單克隆抗體(美國Abcom公司)，Annexin V-APC凋亡試劑盒(Ebioscience美國公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，DMEM/HIGH培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，Trizol RNA提取試劑盒、DAPI試劑(美國Invitrogen公司)，Transwell遷移小室(美國康寧公司)，Caspases-Glo 3/7 Assay試劑(美國Promege公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)分裂時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后每孔將2.5×105個細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到30%時，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2Western blot方法檢測RRS1在MCF-7與正常乳腺上皮細(xì)胞HMEC中的表達(dá) 分別培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞與正常乳腺上皮HMEC細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%時，棄掉培養(yǎng)基，分別用PBS洗1次，采用RIPA裂解法提取總蛋白；BCA法測定并調(diào)整蛋白的濃度，加入5×Loading buffer后煮沸5 min使蛋白高溫變性(變性后可-20 ℃儲存)。然后選用120 g/L的SDS-PAGE不連續(xù)凝膠系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含50 g/L BSA的TBST封閉液緩慢搖床封閉2 h，然后分別用1∶1 000稀釋的鼠抗人RRS1一抗4 ℃孵育過夜，以β-actin作為內(nèi)參蛋白；TBST洗膜3次，每次10 min；用對應(yīng)二抗室溫孵育2 h；重復(fù)TBST洗膜步驟；ECL液按說明書配比并進(jìn)行顯影。

1.2.3siRNA序列設(shè)計(jì) 針對GenBank中RRS1基因的序列(NM_015169)，根據(jù)RNAi序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)出針對目的基因序列的多個RNAi靶點(diǎn)序列，通過軟件評估預(yù)測，篩選出最佳干擾靶點(diǎn)序列為GCTGCCTTCATTGAGTTTA。兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以完成載體構(gòu)建，并在正義鏈3′端添加TTTTT終止信號，反義鏈5′端添加終止信號互補(bǔ)序列，因此正義鏈為5′-CCGGCCGCTG-CCTTCATTGAGTTTACTCGAG(loop)TAAAC-TCAATGAAGGCAGCGGTTTTTG-3′;反義鏈為5′-AATTCAAAAACCGCTGCCTTCATTGAGTTT-ACTCGAG(loop)TAAACTCAATGAAGGCAGC-GG-3′。為了排除載體造成的影響，設(shè)置以亂序?yàn)楹诵男蛄械年幮詫φ?，設(shè)計(jì)原則同上。將兩組RNA分別感染MCF-7細(xì)胞，即得到shRRS1實(shí)驗(yàn)組和shCtrl陰性對照組MCF-7細(xì)胞。

1.2.4慢病毒轉(zhuǎn)染 根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染操作手冊預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出對于實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的MOI值均為20，最適作用時間為9 h。而后換成添加含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后熒光觀察GFP表達(dá)率，即代表病毒轉(zhuǎn)染率，選取達(dá)到90%以上穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5熒光定量PCR(qPCR)檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)水平 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞用Trizol法分別提取總RNA，測定各組RNA濃度與純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行qPCR。反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃暫時保存。合成cDNA后，根據(jù)qPCR試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，為提高特異性，減少引物二聚體和錯配等擴(kuò)增，選用兩步法擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，退火時采集熒光信號，進(jìn)行40個循環(huán)。RRS1基因的上游引物5′-CCCTACCGGACACCA-GAGTAA-3′，下游引物5′-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3′。內(nèi)參基因GAPDH的上游引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，比較兩組細(xì)胞的相對表達(dá)豐度。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.6Western blot方法檢測細(xì)胞RRS1蛋白的表達(dá)水平 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，分別用PBS洗1次，RIPA裂解法提取總蛋白，方法同1.2.2。

1.2.7MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力 取轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞，消化后接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔約4 000個細(xì)胞，共鋪6個板，每天任取一板采用MTT法測細(xì)胞的活力。每個板在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT試劑，4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩5 min使甲瓚顆粒完全溶解，然后用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處各孔的吸光度值，分別制作兩組細(xì)胞的生長曲線。

1.2.8細(xì)胞周期檢測 收集細(xì)胞上清液，并將沖洗用的PBS以及消化后的細(xì)胞與之合并，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入1.5 mL預(yù)冷的PBS洗1次。然后加入4 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇溶液(PBS配制)，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，4 ℃固定24 h，1 000 r/min離心5 min。沉淀用PBS洗1次，后1 000 r/min離心5 min。用200 μL PBS和2 μL濃度為20 mg/L的RNase重懸細(xì)胞，以37 ℃孵育30 min后，加入500 μL濃度為50 mg/L的PI染液，室溫避光孵育30 min。另取一組空管加入PBS 200 μL，將上述細(xì)胞懸液用300目尼龍網(wǎng)過濾至此管混勻，采用流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期。

1.2.9DAPI法檢測細(xì)胞的凋亡情況 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的待檢測細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入適量甲醇固定5 min。棄去固定液后用PBS洗1次，加入少量4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，室溫放置5 min，吸除染色液，用PBS洗滌3次，每次3 min。熒光觀察并拍照。

1.2.10Annexin V-APC單染法檢測細(xì)胞的凋亡情況 分別接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞于6孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)。以不加染料的細(xì)胞作為空白對照。先收集細(xì)胞上清液，胰酶消化細(xì)胞后與上清液合并，1 300 r/min離心5 min，棄上清液，以4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀。再用1×binding buffer洗滌細(xì)胞沉淀1次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入200 μL1×binding buffer重懸細(xì)胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC染色，室溫條件下避光15 min后，加入400 μL 1×binding buffer混勻，立即上機(jī)檢測(一般不超過1 h)。

1.2.11caspase 3/7實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡情況 在化學(xué)發(fā)光專用96孔板中，分別接種兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每孔1×104個細(xì)胞，細(xì)胞懸液體積為100 μL；同時設(shè)置一組不含細(xì)胞的空白對照，每孔只加入100 μL完全培養(yǎng)基；每組設(shè)3個復(fù)孔。然后每孔加入100 μL caspase-Glo反應(yīng)液，將96孔板置于搖板機(jī)上以300～500 r/min的轉(zhuǎn)速輕搖30 min混勻。然后根據(jù)細(xì)胞狀況18～22 ℃室溫孵育0.5～3.0 h(以1～2 h為宜)。采用酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度。

1.2.12Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況 取6只Transwell小室置于24孔板中，為了平衡小室，上室在實(shí)驗(yàn)前加入100 μL無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h。胰酶消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個/L，小心除去上室中的培養(yǎng)基，加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL 含300 g/L FBS的培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)26 h后，倒扣小室于吸水紙上以去除培養(yǎng)基，用棉拭子輕輕拭去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞。甲醇固定15 min，放入結(jié)晶紫染色液中染色15 min。用蒸餾水沖洗掉多余的染液，晾干。顯微鏡下隨機(jī)選取9個視野，計(jì)算每個視野穿過的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的差異。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌細(xì)胞MCF-7與乳腺正常細(xì)胞HMEC中RRS1蛋白的表達(dá)

MCF-7、HMEC中RRS1的蛋白表達(dá)水平分別為0.990±0.017、0.304±0.012，兩組比較，差異有顯著性(t=57.485，P<0.05)。見圖1。

圖1 MCF-7與HMEC中RRS1蛋白的表達(dá)

2.2 敲減后RRS1基因轉(zhuǎn)錄與翻譯水平檢測結(jié)果

對照組、實(shí)驗(yàn)組RRS1 mRNA表達(dá)水平分別為1.083±0.493、0.075±0.065，與對照組相比較，實(shí)驗(yàn)組RRS1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(t=3.513，P<0.05)。對照組、實(shí)驗(yàn)組RRS1蛋白的表達(dá)水分別為1.000±0.079、0.276±0.021，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組RRS1蛋白的表達(dá)水平明顯降低(t=8.890，P<0.05)。見圖2。

2.3 細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果

MTT法檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組，且隨時間的延長差異性越加顯著(t=11.353～36.289，P<0.05)。見表1、圖3。

圖2 MCF-7細(xì)胞中RRS1基因敲降前后蛋白表達(dá)水平的變化

a為對照組；b為實(shí)驗(yàn)組。

2.4 細(xì)胞周期檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組、對照組G1期細(xì)胞構(gòu)成比分別為(68.26±1.58)%、(58.56±3.82)%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.063，P<0.05，n=3)；兩組細(xì)胞G2、S期細(xì)胞構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.5 熒光染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況顯示，實(shí)驗(yàn)組中染色質(zhì)固縮，出現(xiàn)顆粒物質(zhì)以及核解體的現(xiàn)象增多，其相對凋亡率為2.207±0.045，對照組為1.000±0.110，兩組相比較，差異具有顯著性(t=-10.138，P<0.05)。見圖5。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(37.13±0.677)%，對照組為(19.57±1.33)%，兩組比較，差異具有顯著性(t=-11.714，P<0.05)。見圖6。

2.7 caspase 3/7實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

通過對凋亡信號caspase 3/7的檢測，以空白孔為對照，對照組、實(shí)驗(yàn)組的相對發(fā)光量分別為20 119.67±417.56、38 361.67±1 648.42，實(shí)驗(yàn)組caspase 3/7活性相對于對照組明顯增加，差異具有顯著意義(t=-18.581，P<0.05)。見圖7。

a為對照組；b為實(shí)驗(yàn)組。

2.8 細(xì)胞遷移能力的變化

兩組細(xì)胞置于Transwell體系26 h后觀察結(jié)果并拍照。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)移比例為0.433±0.069，對照組為1.000±0.084，兩組相比較，差異有顯著性(t=13.722，P<0.05)。

3 討 論

表1 兩組細(xì)胞增殖活力比較

a為對照組；b為實(shí)驗(yàn)組。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活，以及凋亡相關(guān)分子的狀態(tài)有關(guān)，表現(xiàn)出細(xì)胞持續(xù)增殖，凋亡明顯減少，惡性腫瘤細(xì)胞還伴有高度遷移能力。乳腺癌作為目前全球女性發(fā)病率最高，死亡率居第二位的惡性腫瘤，受到全社會廣泛關(guān)注，乳腺癌治療不足嚴(yán)重威脅著女性的身心健康。

由于蛋白質(zhì)是生命的主要承擔(dān)者，因此腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的供應(yīng)至關(guān)重要。核糖體是蛋白質(zhì)的主要制造車間，核糖體的完整性與功能性對生命體至關(guān)重要。RRS1是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的一種核糖體合成調(diào)控因子，其參與核糖體5S RNP的裝配、60S大亞基的成熟以及細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸過程[12-16]。另外，GAMBE等[17]的研究證明，人宮頸癌HeLa細(xì)胞中RRS1在細(xì)胞分裂間期定位于核仁，分裂過程中則分散于染色質(zhì)周圍，RRS1敲減的HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出染色體排列和紡錘體組裝異常，導(dǎo)致有絲分裂延遲，即RRS1可能參與細(xì)胞有絲分裂過程的染色體行為變化。RRS1還與端粒聚集與沉默以及著絲粒的功能有關(guān)[17-19]。然而RRS1與人類疾病關(guān)系的研究較少，RRS1突變或缺失會引起相應(yīng)細(xì)胞器的功能異常，如參與亨廷頓病的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[20]，以及線粒體疾病的發(fā)生[21]。RRS1與腫瘤關(guān)系的研究更少，特別是與乳腺癌發(fā)病關(guān)系的研究尚未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

a為對照組；b為實(shí)驗(yàn)組。

本研究通過對乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織進(jìn)行成對樣本信息高通量篩選檢測，發(fā)現(xiàn)RRS1在乳腺癌組織中高表達(dá)，這提示RRS1與乳腺癌的關(guān)系密切。為了鑒定RRS1對調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，本實(shí)驗(yàn)采用了慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾乳腺癌MCF-7細(xì)胞中RRS1的表達(dá)，然后檢測MCF-7細(xì)胞的增殖、凋亡與遷移能力等改變，進(jìn)而確定RRS1與乳腺癌的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減RRS1后出現(xiàn)G1期細(xì)胞阻滯、細(xì)胞增殖活力隨時間延長而顯著降低的情況；同時，分別從細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)、細(xì)胞膜上凋亡指示分子以及凋亡信號通路中的關(guān)鍵分子著手研究，均證明敲降RRS1會使MCF-7細(xì)胞凋亡顯著增加；并且，Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲降RRS1表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞的遷移能力也顯著降低。最近有關(guān)于RRS1與肝癌細(xì)胞生長關(guān)系的研究結(jié)果與本課題結(jié)論一致，敲降RRS1表達(dá)會抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，凋亡率增加等[22]，進(jìn)一步證明了RRS1對于腫瘤的促進(jìn)作用。

a為對照組；b為實(shí)驗(yàn)組。

綜上所述，RRS1可能在腫瘤中起到原癌基因的作用，可能成為乳腺癌治療研究中新的分子靶點(diǎn)。接下來我們將探究RRS1對乳腺癌的作用機(jī)制，使RRS1能早日更好地應(yīng)用于乳腺癌臨床治療。

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