木瓜蛋白酶用于選擇性去除齲壞組織的實(shí)驗(yàn)研究

(1 南通市口腔醫(yī)院，江蘇 南通 226001； 2 南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院； 3 南通大學(xué)附屬醫(yī)院)

齲病是導(dǎo)致牙體硬組織進(jìn)行性破壞的一種口腔常見病，臨床表現(xiàn)為牙齒齲壞組織的形成[1-3]。第四次全國口腔健康流行病學(xué)部分調(diào)查結(jié)果顯示，我國兒童患齲率呈上升趨勢，12歲兒童恒牙患齲率約為34.5%。雖然居民口腔保健水平在不斷提高，但齲病仍然是影響居民健康的普遍疾病之一[4]。在過去的傳統(tǒng)齲病治療中使用的非選擇性去齲、預(yù)防性擴(kuò)展等觀念已經(jīng)逐漸被選擇性去齲所替代[5-7]。陳智等[8]根據(jù)硬度，將齲壞牙本質(zhì)分為軟化牙本質(zhì)(soft dentin)、皮革化牙本質(zhì)(1eathery dentin)、韌化牙本質(zhì)(firm dentin)和硬化牙本質(zhì)(hard dentin)；并詳細(xì)介紹了關(guān)于齲壞組織去除的新理念：已脫礦但結(jié)構(gòu)完整的牙本質(zhì)可以再礦化，應(yīng)予以保留，由于粘接修復(fù)技術(shù)的使用，故無需過多去除牙齒硬組織；去齲時(shí)，窩洞側(cè)壁應(yīng)保留硬化牙本質(zhì)，髓壁應(yīng)保留韌化牙本質(zhì)，近髓處可保留軟化牙本質(zhì)防止露髓。

目前，去除齲壞組織多采用渦輪機(jī)機(jī)械去齲和化學(xué)機(jī)械方法去齲[9-11]。與前者相比，結(jié)合齲齒指示劑的使用，化學(xué)機(jī)械法去齲更精準(zhǔn)、微創(chuàng)、無痛。最新研究發(fā)現(xiàn)，齲壞牙本質(zhì)中的膠原纖維斷裂破壞，木瓜蛋白酶可使破壞的膠原纖維水解，進(jìn)而軟化齲壞組織，使用手工器械即可刮除[12]。因此，本研究對不同濃度的木瓜蛋白酶去齲能力進(jìn)行了檢測，并通過掃描電鏡觀察了慢速球鉆去齲和木瓜蛋白酶去齲后牙本質(zhì)表面的不同情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

離體牙(江蘇省口腔醫(yī)院頜面外科)，木瓜蛋白酶(都萊生物公司)，殼聚糖(美國HARVEY)，齲齒指示劑(美國皓齒公司Sable Seek)，低速切割機(jī)(美國標(biāo)樂公司IsoMet)，標(biāo)準(zhǔn)型磁力攪拌器(北京大龍公司MS-S)，掃描電鏡(美國FEI)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1木瓜蛋白酶凝膠的制備 配制40 g/L殼聚糖凝膠后，在上述凝膠中加入不同量的木瓜蛋白酶后充分?jǐn)嚢?，分別制成10、30、50、100 g/L的木瓜蛋白酶凝膠，4 ℃避光保存。

1.2.2實(shí)驗(yàn)牙的選擇及分組處理 在江蘇省口腔醫(yī)院頜面外科門診，收集50例因牙周炎、牙體大面積缺損或阻生而拔除的有牙本質(zhì)齲壞的前磨牙或磨牙(已獲患者知情同意)，且均為活髓牙。新鮮離體牙清潔干凈牙周組織后放入提前預(yù)冷的無菌雙蒸水中，4 ℃保存并盡快用于實(shí)驗(yàn)。將50例牙本質(zhì)齲離體牙隨機(jī)分成40 g/L殼聚糖凝膠組、10 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、30 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、100 g/L木瓜蛋白酶凝膠組5組，每組10例?？焖贉u輪機(jī)去除牙釉質(zhì)齲后，用低速切割機(jī)沿著牙本質(zhì)齲壞部分的中心將每組牙齒縱切為兩半，一半為對照組，使用慢速球鉆去齲；另一半為實(shí)驗(yàn)組，使用不同濃度的木瓜蛋白酶凝膠去齲。

1.2.3慢速球鉆去齲 使用慢速球鉆去除軟化牙本質(zhì)、皮革化牙本質(zhì)、韌化牙本質(zhì)，保留硬化牙本質(zhì)。

1.2.4木瓜蛋白酶凝膠去齲 將不同濃度的木瓜蛋白酶凝膠分別注入齲洞內(nèi)，凝膠與齲壞牙本質(zhì)充分作用30 s，使齲壞牙本質(zhì)軟化，并使用小刮匙用很小的力量即可輕輕刮除，反復(fù)注入凝膠3～4次，直至木瓜蛋白酶凝膠不再使牙本質(zhì)軟化為止，最后通過所用的力度評估剩余牙本質(zhì)的硬度。軟化牙本質(zhì)：在牙科器械加壓時(shí)發(fā)生變形，使用尖銳的手用挖器用很小的力量即可刮除軟化牙本質(zhì)。皮革化牙本質(zhì)：在牙科器械加壓時(shí)不變形，無需太大力量即可被去除。韌化牙本質(zhì)：在手用挖器刮除時(shí)有抵抗力，需要一定的力量才能去除。硬化牙本質(zhì)：在牙科器械探查時(shí)需要加壓，僅鋒利器械或牙鉆可以去除。探針加壓劃過牙本質(zhì)時(shí)可以聽到刺耳的刮擦音。

1.2.5掃描電鏡樣本的制作與觀察 對照組和實(shí)驗(yàn)組離體牙經(jīng)去齲處理后干燥24 h，將標(biāo)本用導(dǎo)電膠固定于樣品臺(tái)上，真空噴金后，進(jìn)行掃描電鏡觀察、攝片。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度木瓜蛋白酶軟化去除牙本質(zhì)齲后剩余牙本質(zhì)硬度的比較

使用小刮匙輕輕刮除軟化牙本質(zhì)后，40 g/L殼聚糖凝膠和10 g/L木瓜蛋白酶凝膠無法使韌化牙本質(zhì)齲繼續(xù)軟化(圖1A、B)；30 g/L木瓜蛋白酶凝膠作用于韌化牙本質(zhì)后可使其軟化，使用小刮匙輕輕刮除被軟化的牙本質(zhì)后，牙本質(zhì)硬度介于韌化牙本質(zhì)和硬化牙本質(zhì)之間(圖1C)；50 g/L木瓜蛋白酶凝膠作用于牙本質(zhì)齲，使用小刮匙輕輕刮除被軟化的牙本質(zhì)后，余牙本質(zhì)層為硬化牙本質(zhì)(圖1D)；100 g/L木瓜蛋白酶凝膠作用于牙本質(zhì)齲，使用小刮匙輕輕刮除被軟化的牙本質(zhì)后，剩余牙本質(zhì)層也為硬化牙本質(zhì)(圖1E)。各組剩余牙本質(zhì)使用齲齒指示劑染色后發(fā)現(xiàn)，40 g/L殼聚糖凝膠和10 g/L木瓜蛋白酶凝膠組剩余牙本質(zhì)被齲齒指示劑著色；30 g/L木瓜蛋白酶凝膠組剩余牙本質(zhì)部分著色；而50 g/L和100 g/L木瓜蛋白酶凝膠組剩余牙本質(zhì)不著色。

2.2 掃描電鏡下觀察

掃描電鏡下，慢速球鉆去齲和50 g/L木瓜蛋白酶凝膠化學(xué)機(jī)械去齲后，慢速球鉆組牙本質(zhì)表面較平坦(圖2A)，牙本質(zhì)玷污層較明顯(圖2C)；木瓜蛋白酶凝膠組牙本質(zhì)表面凹凸不平(圖2B)，牙本質(zhì)玷污層較少(圖2D)。

3 討 論

長期以來，去除齲壞組織常規(guī)采用單純的機(jī)械方法，即使用高速或低速渦輪機(jī)機(jī)械磨除牙體組織，并預(yù)備出一定的固位形和抗力形[13-14]。這種方法雖然能夠快速地去除齲壞組織，但磨牙時(shí)不能準(zhǔn)確區(qū)分齲壞與健康的組織，常常過多地磨除健康牙體組織，并且容易對牙髓組織造成損傷[15]。磨牙時(shí)還會(huì)出現(xiàn)令病人恐懼的疼痛感。而化學(xué)機(jī)械方法去齲在一定程度上能夠避免單純機(jī)械磨除法產(chǎn)生的上述問題[16-18]?；瘜W(xué)機(jī)械法通過化學(xué)材料作用于齲壞組織后，選擇性地軟化齲壞的牙本質(zhì)，利用比較銳利的手工牙科器械就可將軟化的齲壞牙本質(zhì)刮除干凈，并且不破壞健康的牙體組織，它是一種精準(zhǔn)的、微創(chuàng)的去除齲壞組織方式，代表了口腔醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)治療的未來發(fā)展的趨勢[19-21]。

本研究結(jié)果表明，50 g/L和100 g/L濃度的木瓜蛋白酶可以軟化韌化牙本質(zhì)，而對硬化牙本質(zhì)無顯著影響。對于牙本質(zhì)淺層齲、中層齲，可以使用含有50 g/L的木瓜蛋白酶去除齲壞至硬化牙本質(zhì)層，有效防止過多的破壞健康牙體組織。而對于近髓的牙本質(zhì)深齲，應(yīng)予以保留近髓處的軟化牙本質(zhì)，通過氫氧化鈣間接蓋髓術(shù)使牙本質(zhì)再礦化，盡可能地保護(hù)牙髓組織，避免露髓的發(fā)生[22]。研究表明，軟化牙本質(zhì)冠方的嚴(yán)密充填可以有效阻止齲損的進(jìn)行性發(fā)展，這可能與粘結(jié)材料嚴(yán)密充填冠方的窩洞后，控制了剩余軟化牙本質(zhì)的生物膜和齲活性有關(guān)，使齲損不再進(jìn)一步發(fā)展，軟化牙本質(zhì)得以再礦化[23]。

A、B、C、D、E分別為40 g/L殼聚糖凝膠組、10 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、30 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、100 g/L木瓜蛋白酶凝膠組。

圖1不同濃度木瓜蛋白酶去齲后牙本質(zhì)著色程度

A、B、C、D分別為慢速球鉆組(放大1 000倍)、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組(放大1 000倍)、慢速球鉆組(放大2 000倍)、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組(放大2 000倍)。

圖2恒牙去齲后牙本質(zhì)表面形態(tài)

本研究掃描電鏡結(jié)果表明，木瓜蛋白酶去齲后，牙本質(zhì)表面凹凸不平。粗糙的表面加大了粘結(jié)面積，使粘結(jié)劑、樹脂與牙面間形成更加牢固的結(jié)合，這些情況更有利于窩洞側(cè)壁的粘結(jié)修復(fù)，使充填更加嚴(yán)密[24]。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)木瓜蛋白酶處理后的牙本質(zhì)表面玷污層較少。眾多研究表明，去除玷污層后有利于增加粘結(jié)強(qiáng)度。但也有研究認(rèn)為，隨著粘結(jié)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，玷污層不會(huì)對樹脂粘結(jié)造成顯著影響[25-27]。

綜上所述，木瓜蛋白酶能夠選擇性地去除齲壞牙本質(zhì)，對硬化牙本質(zhì)無顯著影響，能夠最大限度地保存健康牙體組織，可以成為一種精準(zhǔn)、微創(chuàng)、安全無痛的去齲方式。

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