蛹蟲草菌靜息細胞培養(yǎng)方法及纖溶酶的誘導(dǎo)研究

劉曉蘭，鄧永平，王漢峰，艾瑞波，王 偉，杜國軍

（1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省普通高等學(xué)校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

血栓栓塞性疾病嚴重危害人類健康，纖溶酶或纖溶酶原激活劑可以直接或間接溶解血栓構(gòu)成成分—血纖維蛋白[1]。纖溶酶存在于多種動物、植物和微生物中[2-4]。微生物種類多樣，生長周期短，并且發(fā)酵技術(shù)相對較成熟，可在較短的時間內(nèi)獲得大量的目的產(chǎn)物[5]，因此，成為開發(fā)新型纖溶酶的主要來源。已有報道源自細菌的納豆激酶（nattokinase，NK）[6]、枯草激酶[7]等，源自鏈霉菌[8]的纖溶酶，源自中華根霉[9]、鐮刀霉[10]、枯青霉[11]、好食脈孢霉[1]等霉菌的纖溶酶以及源自金針菇[12]、蛹蟲草[13-14]等大型真菌的纖溶酶。

靜息細胞是指處于休眠狀態(tài)，但能維持其生存與產(chǎn)物合成能力的細胞[15]。用靜息細胞體系來研究酶合成的影響因子，可以排除菌體生長對酶合成的影響；而且靜息細胞培養(yǎng)基的成分比較簡單，便于對實驗結(jié)果進行分析。冮潔等[16]建立了基因工程菌里氏木霉306的靜息細胞培養(yǎng)體系，并利用該體系確定半胱氨酸、精氨酸、麥芽糖等對組織型纖溶酶原激活劑（tissue type plasminogen activator，t-PA）具有直接誘導(dǎo)作用。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱為北蟲草，是藥食兼用的大型真菌，含有抗癌、抗氧化等多種生理活性成分。蛹蟲草菌纖溶酶的合成屬于部分生長偶聯(lián)型，其特征是菌體生長到達快速生長期末期，細胞仍然具有較強的纖溶酶合成能力[17]。為了排除菌體生長對酶誘導(dǎo)合成的影響，本實驗研究了蛹蟲草菌靜息細胞培養(yǎng)方法，并利用該方法研究了酪蛋白肽對纖溶酶合成的直接誘導(dǎo)作用，以期為提高蛹蟲草菌纖溶酶的活力提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

蛹蟲草菌（Cordyceps militaris，保藏號：CGMCC No.2577）：分離自大興安嶺林區(qū)，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

牛血纖維蛋白原、牛凝血酶（500 U/mL）：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血研所；酪蛋白、氯化鈉、尿素、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、馬鈴薯200 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、馬鈴薯200g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，豆餅粉50 g/L。

血纖維蛋白平板配制：稱取0.125 g瓊脂糖加入27 mL生理鹽水中，待其溶解后，放置于45℃水浴中保溫30 min，加入500 U/mL的凝血酶250 μL，混勻，制得凝血酶溶液。取1支80 mg/支血纖維蛋白原溶于27 mL HCl-巴比妥鈉緩沖液（pH7.8）中，置于45℃水浴中保溫5 min，制得纖維蛋白原溶液?？焖偃? mL凝血酶溶液與5 mL血纖維蛋白原溶液加入直徑為9 cm的平皿中，混勻，水平放置30 min后置于冰箱中備用。

1.2 儀器與設(shè)備

PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；DZP-2F雙層振蕩培養(yǎng)箱：金壇市城西崢嶸儀器廠；pHS-25型酸度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；himac CF15RX冷凍離心機：天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將蛹蟲草菌株挑取至改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上，23℃培養(yǎng)7 d。

平板培養(yǎng)：挑取斜面培養(yǎng)物，接入改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中，23℃培養(yǎng)15 d。

種子培養(yǎng)：用無菌打孔器在平板培養(yǎng)物上取出直徑1.5 cm的菌塊，接種到裝液量為100 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基，23℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

液體發(fā)酵：將液體種子按10%（V/V）接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，23℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

饑餓培養(yǎng)：將液體發(fā)酵產(chǎn)物在4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，收集菌絲體，用無菌生理鹽水洗滌菌絲體3次，按300 mg濕菌體/mL生理鹽水配制成菌懸液，于23℃、180 r/min條件下饑餓培養(yǎng)5 h，即得饑餓細胞菌懸液。饑餓培養(yǎng)的目的是為了耗盡接入靜息培養(yǎng)基的菌體中的纖溶酶，保證靜息培養(yǎng)后檢測到的酶活力均由靜息培養(yǎng)所得。

1.3.2 靜息培養(yǎng)條件的確定

將饑餓培養(yǎng)的菌體接入靜息細胞培養(yǎng)基（裝液量為30 mL/250 mL），通過實驗確定合適的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件。

氮源的確定：以1.0g/L葡萄糖作為碳源，0.6g/LNaNO3、尿素、NH4NO3和（NH4）2SO4分別作為氮源，接種量10%，于180 r/min、23℃培養(yǎng)12 h后，測定生物量和纖溶酶活力。以饑餓培養(yǎng)后的蛹蟲草生物量和纖溶酶活力作為對照1，生理鹽水中培養(yǎng)12 h的生物量及纖溶酶活力作為對照2。確定最佳氮源后，考察最佳氮源添加量（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L）對菌體生物量和纖溶酶活力的影響，以確定最佳碳源添加量。

葡萄糖添加量的確定：以0.6 g/L的尿素為氮源，葡萄糖添加量分別為0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L，接種量10%，在180 r/min、23℃培養(yǎng)12 h后，測定菌體生物量及纖溶酶活力。以饑餓培養(yǎng)后的蛹蟲草生物量和纖溶酶活力作為對照1。

培養(yǎng)條件的確定：通過單因素試驗考察接種量（8%、9%、10%、11%、12%）、培養(yǎng)時間（10 h、12 h、14 h、16 h、18 h）和培養(yǎng)基初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對蛹蟲草菌靜息培養(yǎng)生物量和纖溶酶活力的影響。

1.3.3 酪蛋白肽對蛹蟲草纖溶酶的誘導(dǎo)作用

利用蛹蟲草菌發(fā)酵液中的蛋白酶（152 U/mL）水解酪蛋白（含量為2.4%，pH 7.4），水解時間5 min，水解度為1.5%。蛋白質(zhì)水解度的測定采用pH-state法[18]。酪蛋白水解物中肽的分離路線見圖1。

圖1 酪蛋白肽的分離路線Fig.1 Separation process of the casein peptide

將實驗室自制的上述5種不同的酪蛋白肽（分別為組分A、B、C1、C2、C3）加入已經(jīng)優(yōu)化的靜息細胞培養(yǎng)基中，添加量為0.1 g/L，接種后于23℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，測菌體生物量和纖溶酶活力，對照組不添加酪蛋白肽。

1.3.4 生物量測定

菌體生物量的測定采用稱干質(zhì)量法[19]。取靜息細胞培養(yǎng)液，置于預(yù)先烘干至恒質(zhì)量的濾紙上，用布氏漏斗抽干后，用蒸餾水洗滌2次，60℃烘干至質(zhì)量恒定，測定菌絲體干質(zhì)量，即為生物量，平行實驗3次。

1.3.5 纖溶酶活力的測定方法

采用血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力[13]。取10 μL粗酶液點加于血纖維蛋白平板表面，37℃保溫6 h后測定溶圈直徑，計算溶圈面積。血纖維蛋白是構(gòu)成血栓的主要成分，因此，以水解血纖維蛋白后在平板上形成的溶圈面積表示纖溶酶的活力。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2003和SPSS 11.5分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并結(jié)合Duncan氏法做多重比較，實驗均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標準差表示（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜息培養(yǎng)條件的確定

2.1.1 氮源對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響

考察4種氮源對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 氮源對蛹蟲草菌生物量和纖溶酶活力的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由圖2可知，當尿素作為氮源時，生物量與對照的差異最小，纖溶酶活力最高，說明細胞處于靜息狀態(tài)，尿素沒有影響細胞生長狀態(tài)，但是對纖溶酶的合成有促進作用。其他氮源都是無機氮源，也是速效氮源，導(dǎo)致生物量有不同程度增加，其中硝酸鈉為氮源時生物量增量最大，但是均未檢測到纖溶酶活力，所以，選擇尿素為靜息培養(yǎng)基氮源。

尿素添加量對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響見圖3。

由圖3可知，尿素添加量為0.2～0.6 g/L時，與對照1和對照2相比，生物量沒有顯著變化（P＞0.05），說明細胞仍處于靜息狀態(tài)；當尿素添加量為0.8 g/L時，生物量由1.07 g/L增至1.48 g/L，說明此時細胞脫離靜息狀態(tài)。對照1中細胞饑餓培養(yǎng)后測得的纖溶酶活力近似于0，對照2中細胞經(jīng)生理鹽水培養(yǎng)12 h后合成了纖溶酶，但是活力較低。隨著培養(yǎng)基中尿素添加量的增加纖溶酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，當尿素添加量為0.6 g/L時，纖溶酶活力最高。綜上所述，確定尿素的添加量為0.6 g/L。

圖3 尿素添加量對蛹蟲草菌生物量和纖溶酶活力的影響Fig.3 Effect of urea addition on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

2.1.2 葡萄糖添加量對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響

葡萄糖添加量對菌體生物量及纖溶酶活力的影響見圖4。

圖4 葡萄糖添加量對蛹蟲草菌體生物量及纖溶酶活力的影響Fig.4 Effect of glucose addition on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由圖4可知，對照為蛹蟲草菌細胞經(jīng)過饑餓培養(yǎng)后測得的生物量（2.23 g/L）和纖溶酶活力（近似于0）。與對照相比，生物量隨葡萄糖添加量的變化無顯著變化（P＞0.05），說明在實驗范圍內(nèi)細胞處于休眠狀態(tài)。當葡萄糖添加量為0～0.8g/L時，隨著葡萄糖添加量的提高纖溶酶活力呈增加趨勢，當葡萄糖添加量為0.08%時，纖溶酶活力最高，繼續(xù)提高葡萄糖添加量至1.0g/L時，酶活力顯著降低（P＜0.05）。因此確定葡萄糖的添加量為0.8 g/L。

2.1.3 接種量對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響

接種量對菌體生物量及纖溶酶活力的影響見圖5。

由圖5可知，生物量隨著接種量（8%～12%）的增加呈上升趨勢，但是變化幅度較小，說明細胞處于靜息狀態(tài)。纖溶酶活力隨著接種量的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當接種量為10%時，纖溶酶活力最大。因此確定接種量為10%。

圖5 接種量對蛹蟲草菌體生物量及纖溶酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

2.1.4 靜息培養(yǎng)時間對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響

靜息細胞培養(yǎng)的一個要求是在盡量短的時間內(nèi)考察不同物質(zhì)對微生物合成某種代謝產(chǎn)物的影響。如果靜息培養(yǎng)時間過長，則會由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，引起菌體死亡；但是如果靜息細胞培養(yǎng)時間過短，則會由于菌體沒有合成足夠量的纖溶酶而使纖溶酶難以測定，增加實驗的誤差。因此確定合適的靜息細胞培養(yǎng)時間對于靜息細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立十分重要。靜息培養(yǎng)時間對菌體生物量及纖溶酶活力的影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)時間對蛹蟲草菌體生物量及纖溶酶活力的影響Fig.6 Effect of culture time on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由圖6可知，在培養(yǎng)時間為10～18 h范圍內(nèi)，菌體生物量沒有明顯變化（P＞0.05），說明菌體處于休眠狀態(tài)。纖溶酶的活力隨培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當培養(yǎng)時間為12h時纖溶酶活力最高。因此，確定靜息細胞培養(yǎng)時間為12 h。

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響

培養(yǎng)基初始pH影響微生物原生質(zhì)膜所帶的電荷，也會影響到某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解和電離程度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。培養(yǎng)基初始pH對蛹蟲草菌靜息細胞生物量及纖溶酶活力的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對蛹蟲草菌體生物量及纖溶酶活力的影響Fig.7 Effect of initial pH of medium on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由圖7可知，培養(yǎng)基初始pH對菌體生物量有顯著影響（P＜0.05），當培養(yǎng)基初始pH為6.0～7.0時，生物量較穩(wěn)定；隨培養(yǎng)基初始pH的增加，纖溶酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，纖溶酶活力最高，此pH值與蛹蟲草纖溶酶的最適作用pH較一致[13]，因此，確定靜息細胞培養(yǎng)基初始pH值為7.0。

優(yōu)化靜息細胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件后得到蛹蟲草菌生物量為2.38g/L、纖溶酶在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積為34.97 mm2。

2.2 酪蛋白肽對蛹蟲草菌生物量及纖溶酶活力的影響

在微生物發(fā)酵過程中，細胞生長、代謝產(chǎn)物合成、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、培養(yǎng)基組成及環(huán)境pH值的改變等因素都會直接影響到酶的合成。利用靜息細胞培養(yǎng)系統(tǒng)研究酶的誘導(dǎo)，可以克服細胞生長等因素對酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的影響，而且培養(yǎng)基組成較為簡單，便于分析。

以酪蛋白肽作為纖溶酶待選誘導(dǎo)物，研究不同組分酪蛋白肽對蛹蟲草菌生物量和纖溶酶活力的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 不同組分酪蛋白肽對蛹蟲草菌纖溶酶誘導(dǎo)作用的影響Fig.8 Effect of casein peptide with molecular mass distribution on fibrinolytic enzyme induction byC.militaris

由圖8可知，和對照組相比，靜息培養(yǎng)基中添加酪蛋白肽組分A（6 mol/L鹽酸沉淀物）、C1（分子質(zhì)量≤3 500 Da）可提高菌體生物量，添加組分C3（7 000 Da＜分子質(zhì)量≤14 000 Da）導(dǎo)致菌體生物量降低，添加組分B（5%三氯乙酸沉淀物）和C2（3 500 Da＜分子質(zhì)量≤7 000 Da）的酪蛋白肽對菌體生物量無顯著影響（P＞0.05），表明菌體均處于休眠狀態(tài)。分析酶活力可知，組分A、C1、C2和C3的酪蛋白肽均可作為蛹蟲草菌纖溶酶的誘導(dǎo)物，而組分B的培養(yǎng)物中酶活力低于對照，因此不是纖溶酶誘導(dǎo)物。組分A、C1和C3對纖溶酶的合成與菌體生長有關(guān)，因為與對照相比，這三個組分的培養(yǎng)物中酶活力提高的同時生物量均有不同程度的升高或降低；培養(yǎng)基中添加組分C2幾乎沒有改變生物量，因此組分C2是直接誘導(dǎo)纖溶酶的合成，且誘導(dǎo)作用最顯著（P＞0.05），高于對照264%。

酪蛋白中含有精氨酸、絲氨酸等多種氨基酸[20-21]，其中精氨酸對基因工程菌里氏木霉306表達的t-PA有直接誘導(dǎo)作用，使酶活力提高了39.76%[16]。蛹蟲草纖溶酶是一種絲氨酸蛋白酶[13]，酪蛋白肽對其誘導(dǎo)作用可能與肽的氨基酸構(gòu)成有關(guān)。酪蛋白肽的誘導(dǎo)機理將在后續(xù)工作中深入研究。

3 結(jié)論

本研究以生物量和纖溶酶活力為評價指標，對蛹蟲草菌靜息細胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了研究。確定靜息細胞培養(yǎng)基由0.08%葡萄糖和0.06%尿素組成，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH 7.0，接種量為10%，180 r/min、23℃靜息培養(yǎng)12 h。在此條件下，蛹蟲草菌生物量為2.38 g/L，纖溶酶在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積為34.97 mm2。通過靜息細胞培養(yǎng)系統(tǒng)初步確定酪蛋白肽C2對纖溶酶有直接誘導(dǎo)作用，使酶活力提高了264%。本研究為蛹蟲草菌纖溶酶誘導(dǎo)物的確定提供了研究基礎(chǔ)，對于高產(chǎn)纖溶酶的發(fā)酵工藝的研究具有較重要的意義。

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