超聲浸提-高效液相色譜法測定刺三加葉中綠原酸

高林曉，郭 蒙*，王玉林，毛海立，楊再波

（1.黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻 558000；2.貴州省普通高校民族藥用植物資源開發(fā)工程研究中心，貴州 都勻 558000）

刺三加（Acanthopanax trifoliatusL.Merr.）為五加科五加屬攀援狀灌木，別名有白簕、白簕根、三加皮、三葉五加、刺三甲和簕鉤菜等，其嫩芽富含粗纖維和多種微量元素，有改善胃腸功能、清熱解毒、防治心腦血管疾病、抗疲勞、減肥等功效[1]。刺三加葉中富含黃酮、酚酸和苯丙素類等物質(zhì)，其中綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[2]。刺三加茶作為廣東恩平特色的農(nóng)產(chǎn)品已進(jìn)入人們的視野，一條刺三加產(chǎn)業(yè)鏈已初步形成[3]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，綠原酸含量測定的方法主要有紫外分光光度法[4-5]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[6-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、電化學(xué)法[13]和伏安法[14]等。這些方法在實際應(yīng)用中都存在一定的局限。紫外分光光度法不能消除綠原酸同分異構(gòu)體在同一波長下也存在吸收峰的干擾，結(jié)果嚴(yán)重偏高；毛細(xì)管電泳法中電滲會因樣品組成而變化，進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性，由于毛細(xì)管直徑小，使光路太短，用一些檢測方法時，靈敏度較低；電化學(xué)法受干擾物，環(huán)境外界影響因素較大。已報道測定刺三加中綠原酸含量的方法有紫外分光光度法[4]，但鮮有高效液相色譜法測定刺三加葉中綠原酸含量的方法報道。

本研究采用超聲浸提-高效液相色譜法建立快速測定刺三加葉中綠原酸含量的方法，以期為制定科學(xué)合理的刺三加質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗中所用刺三加葉分別采自貴州省天柱縣渡馬鄉(xiāng)和廣東恩平。由黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院黃小娜副教授鑒定為五加科五加屬植物刺三加葉。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；乙醇（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；石油醚（分析純）：天津市化學(xué)試劑供銷公司；蒸餾水為實驗室自制；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.09%，批號：LC18522）：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；FW177高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵：鄭州英三谷華儀器有限公司；BS110S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DL-360D智能超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

稱取干燥并粉碎的刺三加葉8.00 g，過40目篩，置于250 mL錐形瓶中，加10倍煮沸的蒸餾水浸提3 min，冷卻后進(jìn)行粗濾。再加10倍水同法處理，抽濾，棄去浸提液，得濾渣。加100 mL石油醚于濾渣中脫脂、脫色3 h，重復(fù)4次，至石油醚層近無色，抽濾，傾去醚液，樣品置于通風(fēng)處干燥備用。準(zhǔn)確稱取上述刺三加葉粉末2.000 2 g置150 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液100 mL，超聲間歇提取2次，每次30 min，超聲功率100 W，合并提取液，減壓蒸干，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，用0.45 μm的有機(jī)相微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液[15-16]。

1.3.2 綠原酸檢測的色譜條件

采用高效液相色譜法檢測刺三加葉中綠原酸的含量。色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2%磷酸水（15∶85，V/V）溶液；檢測波長327 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。

1.3.3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0052g，置于25mL棕色容量瓶中，加入1.0mL甲醇溶解，再加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，配制成0.208mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；精密吸取上述溶液2.0 mL置于100 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（質(zhì)量濃度為4.16μg/mL），放置于2～8℃冰箱避光保存。

分別精密吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL和10.0 mL質(zhì)量濃度為4.16 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.08 μg/mL、0.21 μg/mL、0.42μg/mL、0.83μg/mL、1.25μg/mL、1.66μg/mL、2.08μg/mL、2.50 μg/mL和4.16 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得溶液用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，按照1.3.2色譜條件測定峰面積，并以綠原酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的確定

在波長200～400 nm范圍內(nèi)對一定質(zhì)量濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外吸收掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，綠原酸在波長218 nm及327 nm處有最大紫外吸收，考慮到波長218 nm左右紫外吸收有較多物質(zhì)干擾，同時該波長接近流動相甲醇的紫外截止波長，對樣品測定會有一定影響，故選擇327 nm作為檢測綠原酸的最佳波長。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描圖Fig.1 UV scanning graph of chlorogenic acid standard substance

2.2 色譜條件的優(yōu)化選擇

分別考察了甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸和甲醇-水-甲酸等流動相系統(tǒng)[17-21]，預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.2%磷酸水溶液（15∶85，V/V）進(jìn)行分離的分析效果較好，在該流動相下，刺三加葉中綠原酸的分離度符合要求，具有重現(xiàn)性好、背景噪音干擾小和所得峰形對稱性好等優(yōu)點，所以最終選擇甲醇-0.2%磷酸水（15∶85，V/V）溶液為流動相?？疾熘鶞兀?0℃、25℃、30℃、35℃）、體積流量（0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min）對綠原酸的分離效果，結(jié)果柱溫30℃、體積流量為1.0 mL/min峰型對稱性好，理論板數(shù)高，分離效果較佳。

2.3 供試品溶液制備方法的優(yōu)化選擇

比較了以甲醇、乙醇和蒸餾水分別作溶劑，使用超聲的方法提取，為了防止綠原酸在較高溫度條件下降解，超聲過程控制溫度為20℃。實驗發(fā)現(xiàn)以蒸餾水作為提取溶劑時有效成分的提取率較低，且雜質(zhì)較多，以甲醇、乙醇作為提取溶劑時，有效成分的峰形及含量無顯著差異，考慮到甲醇的毒性比乙醇大，故選擇乙醇為提取溶劑。在此基礎(chǔ)上，又對乙醇的體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）及超聲提取時間（10 min、20 min、30 min、40 min）進(jìn)行了考察，確定體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，20℃超聲提取30 min，并旋蒸濃縮，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液溶解定容于100 mL棕色容量瓶中，綠原酸提取最佳。因此本實驗選用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液超聲處理30 min，旋蒸濃縮樣品的提取方法。

2.4 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品高效液相色譜分析

按照“1.3.2”項下色譜條件，采用高效液相色譜法分別檢測了刺三加葉中提取綠原酸的供試品溶液、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品及體積分?jǐn)?shù)60%乙醇的空白溶液，結(jié)果見圖2。由圖2可知，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為25.653 min，峰形較窄，對稱性好。樣品提取液中綠原酸的保留時間為25.656 min，與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間幾乎沒有差別，由此可以判定刺三加葉提取液中含有綠原酸。

圖2 空白（A）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（B）和供試品（C）的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of blank(A),chlorogenic acid standard substance(B)and sample(C)

2.5 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用高效液相色譜法測定綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積，以綠原酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸方程，結(jié)果見圖3。

圖3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of chlorogenic acid

由圖3可知，綠原酸線性回歸方程為A=35.2081C+1.9462，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996，表明綠原酸質(zhì)量濃度在0.08～4.16μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，可根據(jù)線性回歸方程計算刺三加葉中綠原酸的含量。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取2.08 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按“1.3.2”節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄綠原酸的峰面積，計算綠原酸含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表1。由表1可知，綠原酸含量的RSD為0.81%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

2.6.2 重復(fù)性試驗

精密移取“1.3.1”節(jié)中同一批供試品溶液適量，取樣6份，再按“1.3.4”節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄供試品中綠原酸峰面積，計算綠原酸含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果見表2。由表2可知，綠原酸含量的RSD為0，表明該方法重復(fù)性好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Results of repeatability experiments

2.6.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“1.3.1”節(jié)中同一批供試品溶液適量，分別于室溫條件下放置0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄供試品溶液中綠原酸峰面積，計算綠原酸含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果見表3。由表3可知，綠原酸含量的RSD為0.19%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 Results of stability experiments

2.6.4 定量限與檢測限

按“1.3.2”節(jié)中色譜條件，取4.16 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度溶液進(jìn)樣測定。當(dāng)信噪比（峰高與基線噪音之比）S/N=10±1時，綠原酸的定量限為0.021 μg/mL；當(dāng)信噪比S/N=3±1時，綠原酸的檢測限為0.007 μg/mL，結(jié)果見表4。由表4結(jié)果表明，儀器的噪音低，靈敏度高。

表4 定量限與檢測限試驗結(jié)果Table 4 Experiment results of limits of quantitation and detection

2.6.5 加樣回收率試驗

按照1.3.1樣品處理方法平行制取6份供試品溶液，各精密吸取0.15 mL供試品溶液，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液溶解定容至10 mL棕色容量瓶中，搖勻，從上述6份供試品溶液中各移取0.15mL，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（4.16μg/mL）5mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容，搖勻，按“1.3.2”節(jié)中色譜條件測定，并計算綠原酸總含量，結(jié)果見表5。由表5可知，綠原酸平均回收率為99.76%，RSD值為1.17%，＜5%，表明該方法準(zhǔn)確度高，符合實驗對于定量的要求。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果Table 5 Results of adding standard recovery experiments

2.7 樣品中綠原酸含量的測定

取不同地區(qū)刺三加葉3批樣品分別按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，再按照“1.3.2”節(jié)中色譜條件進(jìn)樣測定并計算綠原酸含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=3），結(jié)果見表6。由表6可知，貴州渡馬鄉(xiāng)刺三加葉中綠原酸的含量最高為8.51 mg/g，廣東恩平刺三加葉中綠原酸的含量最低為7.84 mg/g，可見不同地區(qū)刺三加葉中綠原酸的含量有一定的差異，但差異不明顯。

表6 不同地區(qū)樣品中綠原酸含量的測定結(jié)果Table 6 Determination results of chlorogenic acid contents in the samples from different regions

3 結(jié)論

本研究確定了刺三加葉中綠原酸含量測定的最佳HPLC檢測條件為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相選用甲醇-0.2%磷酸水溶液（15∶85，V/V）；檢測波長327 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣10 μL；柱溫30℃。并在上述條件下進(jìn)行了方法學(xué)驗證，結(jié)果表明其方法操作簡便，具有良好的精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。并在此基礎(chǔ)上，測定了不同地區(qū)刺三加葉中綠原酸的含量，測定結(jié)果表明貴州渡馬鄉(xiāng)刺三加葉中綠原酸的含量最高為8.51 mg/g，不同地區(qū)刺三加葉中綠原酸的含量有一定差異，但差異不明顯。

[1]李文芳，晏 麗，向 寧.刺三加葉組成成分與質(zhì)量分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（8）：1077-1080.

[2]吳衛(wèi)華，康 楨，歐陽冬生，等.綠原酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（4）：691-694.

[3]林春華，林偉君，譚 雪，等.野生蔬菜簕菜品質(zhì)及急性毒性試驗研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（2）：201-202.

[4]向昌國，李文芳，聶 琴，等.甘薯莖葉中綠原酸提取方法的研究及含量測定[J].食品科學(xué)，2007，28（1）：126-130.

[5]王 輝，田呈瑞，馬守磊.綠原酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2009，30（5）：341-345.

[6]唐 柯，馬 磊，徐 巖，等.超高效液相色譜法快速測定葡萄酒中酚酸[J].中國釀造，2015，34（12）：157-161.

[7]張雪梅，謝金芮，陳玉甫，等.全酶解法提取杜仲葉中綠原酸及其含量測定[J].中國釀造，2016，35（10）：149-152.

[8]ZHAO Q,WU X X,ZHOU J,et al.RP-HPLC determination of chlorogenic acid inLycium barbarumL.extract and its protective effect on retinal ganglion[J].Biomed Res India,2017,28(11):4869-4873．

[9]ZHANG Z H,PAN T W.HPLC determination of chlorogenic acid in Verbena officinalisL.extract and itsin vitroantibacterial activity[J].Biomed Res India,2017,28(9):3996-4001.

[10]LUO X L,LI N,XU M,et al.HPLC simultaneous determination of arbutin,chlorogenic acid and 6'-O-caffeoylarbutin in different parts of Vaccinium dunalianumwight[J].Biomed Res India,2015,29(20):1963-1965.

[11]SINGH A,BAJPAI V,KUMAR S,et al.Quantitative determination of isoquinoline alkaloids and chlorogenic acid inBerberisspecies using ultra high performance liquid chromatography with hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry[J].J Sep Sci,2015,38(12):2007-2013．

[12]LI Z B,HUANG D N,TANG Z X,et al.Fast determination of chlorogenic acid in tobacco residues using microwave-assisted extraction and capillary zone electrophoresis technique[J].Talanta,2010,82(4):1181-1185．

[13]瞿萬云，吳 艷，胡衛(wèi)兵.基于納米Nb2O5/石墨烯復(fù)合材料的增強(qiáng)效應(yīng)電化學(xué)測定綠原酸[J].分析測試學(xué)報，2017，36（3）：319-324.

[14]DAVID I.G,POPA D E,BULEANDRA M,et al.Cheap pencil graphite electrodes for rapid voltammetric determination of chlorogenic acid in dietary supplements[J].Anal Method,2016,8(35):6537-6544．

[15]蔡凌云，肖 娟，韓素菊，等.白簕葉中黃酮成分的鑒定和含量測定[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報，2010，29（11）：78-84.

[16]蔡凌云，黎云祥，陳 焦，等.白簕根皮總黃酮提取工藝研究[J].食品科學(xué)，2009，30（4）：15-18.

[17]錢 程，陳玉娥，黃 亮，等.HPLC法測定拳參中綠原酸和沒食子酸含量[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2016，39（7）：25-28.

[18]張海娟，黃增榮，隆小華，等.HPLC法測定不同品種不同地區(qū)菊芋葉片中綠原酸的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23（6）：1107-1109.

[19]康 琛，李曼玲，殷文光，等.吳茱萸藥材中綠原酸的含量測定[J].中國中藥雜志，2008，33（17）：2195-2196.

[20]史玉紅.梔子藥材中梔子苷和綠原酸含量測定方法研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，15（6）：38-40.

[21]李 娜，高曉燕，范 強(qiáng)，等.金銀花提取液中綠原酸的快速定量[J].中國中藥雜志，2007，32（4）：312-314.