中華絨螯蟹Timeless基因在不同發(fā)育階段的表達譜分析

李 豪，李 鵬，嚴 潔，解文利，周開亞

(南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210023)

千百年來，地球上的萬物早已適應(yīng)地球晝夜交替的周期性變化，從細菌到哺乳動物，幾乎所有生物體內(nèi)的生理活動和外在行為都表現(xiàn)出其自身的節(jié)律行為[1]。這種生物節(jié)律行為是生物體普遍存在的生命現(xiàn)象，參與多種生命活動的調(diào)控，對幾乎所有生物體中的生化、生理和行為過程都產(chǎn)生深遠的影響。最初人們猜想，這種節(jié)律行為是有機體對周圍環(huán)境的變化產(chǎn)生的進化結(jié)果，但后來的一系列試驗證明當(dāng)無外界因素存在或一直處于黑暗的狀態(tài)下，生物體內(nèi)的各種活動依然具有一定的節(jié)律行為。由此可見，節(jié)律行為是由生物內(nèi)在的生物鐘所控制的[2]。

生物鐘一直是人們研究的焦點之一，它是生命對地球光照以及溫度等環(huán)境因子周期變化長期適應(yīng)而演化的內(nèi)在自主計時機制[3]，賦予生命預(yù)測時間和環(huán)境變化的能力，以協(xié)調(diào)體內(nèi)的生命過程如代謝、生理和行為等[4]。生物鐘機制的研究早在20世紀60年代就深入到分子水平，隨著生物鐘在自然界各級生物中存在的事實相繼被證實[5]，與生物鐘相關(guān)的基因隨后也相繼被分離鑒定出來。最早分離鑒定的生物鐘基因是1971年Konopka等[6]用化學(xué)突變劑乙基甲磺酸處理果蠅后，在單突變?nèi)旧w中發(fā)現(xiàn)的。至今已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了10余個晝夜節(jié)律鐘基因，分別是Period (Per1、Per2、Per3)、隱花色素(Cry1、Cry2)、Clock (circadian locomoter output cycle kaput)、Bmal1 (brain and muscle ARNT-like-1)、Timeless、NPAS2 (Neuronal PAS domain protein 2)和CK1ε (casein kinase 1 isoform ε)等[7]。其中Timeless基因是一個非常重要的時鐘基因，該基因不僅對各種生物多種活動節(jié)律具有協(xié)同進化關(guān)系[8]，同時對哺乳動物胚胎及生長發(fā)育[9-12]、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療[13-15]等方面也發(fā)揮著重要的作用。它在動物器官發(fā)生的初期廣泛表達于大腦、心臟、肝胰腺、肺、胃等器官，如果缺失該基因，則會引起胚胎致死現(xiàn)象[12,16]。

近些年無脊椎動物中眾多物種，如埃及伊蚊(Aedesaegypti)[17]、雙斑蟋(Gryllusbimaculatus)[18]、家蠶(Bombyxmori)[19]、小灶衣魚(Thermobiadomestica)[20]等的Timeless基因研究被相繼報道，其中研究最多的是果蠅Timeless基因。此外，人[21-22]及一些模式生物如小鼠(Musmusculus)[11-12,23]、斑馬魚(Daniorerio)[24-25]等的Timeless基因也有較多研究報道。目前生物鐘基因研究多集中在以下3個方面：(1)發(fā)現(xiàn)生物鐘新基因和新調(diào)節(jié)機制；(2)發(fā)現(xiàn)新鐘控基因和鐘控生命過程；(3)生物鐘在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[4]。迄今甲殼類動物的Timeless基因研究少見報道，尤其是對甲殼動物生物鐘基因在其整個生命過程中的作用還研究較少。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)原產(chǎn)于我國北緯24°以北的中國黃海海岸水域。其自然分布于我國黃海、渤海以及東海沿海城市和內(nèi)陸各省的通海河流中，是我國重要的經(jīng)濟蟹類，其幼體階段包括5個溞狀幼體時期和1個大眼幼體時期，從大眼幼體期開始進入淡水生活，隨后生長進入仔蟹期，經(jīng)多次蛻殼發(fā)育至成蟹[26]。野生的中華絨螯蟹一生有兩次洄游，即索餌洄游和生殖洄游[27]。本研究通過分析中華絨螯蟹Timeless基因在成蟹、扣蟹(未性成熟)不同性別個體的不同組織中的基因表達譜，同時探究中華絨螯蟹Timeless基因在幼體不同發(fā)育階段的相對表達情況，以了解該基因在中華絨螯蟹幼體不同發(fā)育階段和在成蟹、扣蟹雌雄個體不同組織間的mRNA表達時相，以期為進一步研究中華絨螯蟹Timeless基因在其洄游過程中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

試驗用中華絨螯蟹溞狀幼體Ⅰ期、溞狀幼體Ⅱ期、溞狀幼體Ⅲ期、溞狀幼體Ⅳ期、溞狀幼體Ⅴ期、大眼幼體、仔蟹Ⅰ期、仔蟹Ⅱ期、仔蟹Ⅲ期樣品和扣蟹(體質(zhì)量約20 g)、成蟹(體質(zhì)量約100 g)樣品均取自江蘇南通中華絨螯蟹苗種養(yǎng)殖場和江蘇泰州興化中堡中華絨螯蟹養(yǎng)殖場。幼體不同發(fā)育時期樣本分別取不超過30 mg置于加有RNA保護試劑的EP管中，用手術(shù)剪充分剪碎樣品后于-20 ℃保存?zhèn)溆??？坌窐悠啡』睾笤趯嶒炇茵B(yǎng)殖間飼養(yǎng)2周，24 h不間斷充氧，室溫維持在約25 ℃；日投喂食物一次，更換水一次；2周后在活潑健康的個體中隨機挑選3只雌性蟹和3只雄性蟹，并分別取眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、性腺(卵巢、精巢)和心等8個組織。成蟹樣品取回后直接解剖，同樣取眼柄、肝胰腺、胃、卵巢、精巢等8個組織，所有組織均加RNA保護試劑并剪碎混勻，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器和試劑

三氯甲烷(南京丁貝生物科技有限公司)、RNA提取試劑盒：TransZolTMUP Plus RNA Kit(TransGen Biotech)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimescriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa)、熒光分光光度計(Thermo NanDrop 2000/2000C)、冷凍型離心機(Eppendorf 5417R)、PCR儀(Applied Biosystems VeritiTMThermal Cycler)、全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon-3500)，熒光定量PCR儀(ABI Step One PlusTM)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成

取凍存的幼體中華絨螯蟹以及扣蟹、成蟹8個組織(眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、性腺、心臟)樣品，經(jīng)勻漿器研磨后參照RNA提取試劑盒(TransGen Biotech)操作說明書進行總RNA的提取，經(jīng)熒光分光光度計測定濃度和純度，同時用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測各總RNA的完整性。檢測RNA質(zhì)量可用后，取各組織總RNA量1 μg用于合成cDNA第一鏈，合成后的cDNA用于半定量及熒光定量試驗。各組織剩余RNA均于-80 ℃超低溫冰箱存放備用。

cDNA反應(yīng)體系：5× Prime Script RT Master Mix (for Real Time)，4 μL；Easy Dilution (for Real Time PCR)，2 μL；Total RNA(質(zhì)量濃度100 ng/μL)，1 μL；RNease Free deionized H2O，13 μL；總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。合成的cDNA測濃度后于-80 ℃超低溫冰箱存放。

1.2.2 引物設(shè)計和PCR擴增反應(yīng)

采用Primer premier 5.0軟件根據(jù)本課題組前期已獲得的中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組中Timeless基因序列(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)，設(shè)計半定量試驗引物TIM-F/TIM-R以及熒光定量引物qTIM-F/qTIM-R。以中華絨螯蟹的β-actin基因作為內(nèi)參并根據(jù)該基因序列設(shè)計半定量引物β-actin-F/β-actin-R。熒光定量內(nèi)參引物Qβ-actin-F/Qβ-actin-R引用參考文獻[28]。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見表1。

PCR反應(yīng)體系：cDNA模板0.7 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，Mix混合液10 μL，滅菌超純水8.5 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物3 μL經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 中華絨螯蟹Timeless基因半定量和熒光定量表達分析所用引物

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

成蟹和扣蟹時期組織的Timeless基因表達量檢測：根據(jù)設(shè)計好的引物(表1)對兩個時期樣本的各組織(眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、卵巢/精巢、心臟)中Timeless基因的表達情況進行檢測。本試驗樣品和內(nèi)參均設(shè)計了3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR?Premix Ex-TaqTMⅡ(2×)，10 μL；上游引物和下游引物(10 μmol/L)，各0.8 μL；ROX Reference DyeⅡ(50×)*3，0.4 μL；cDNA模板(總量約80 ng)，1.0 μL；雙蒸水，7 μL。反應(yīng)程序95 ℃，30 s；然后進入40個循環(huán)：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；最后95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。反應(yīng)結(jié)束后將熒光定量PCR檢測結(jié)果導(dǎo)出。

幼體不同發(fā)育階段的Timeless基因表達量檢測：用同樣的方法和PCR程序檢測中華絨螯蟹Timeless基因在其9個不同發(fā)育階段(溞狀幼體Ⅰ期、溞狀幼體Ⅱ期、溞狀幼體Ⅲ期、溞狀幼體Ⅳ期、溞狀幼體Ⅴ期、大眼幼體、仔蟹Ⅰ期、仔蟹Ⅱ期和仔蟹Ⅲ期)的表達情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

導(dǎo)出的試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法[29]計算目的基因mRNA的相對表達量并作圖，成蟹和扣蟹時期將精巢和卵巢組織中Timeless基因的相對表達量設(shè)定為參照，幼體的9個發(fā)育階段將溞狀幼體Ⅰ期的Timeless基因相對表達量設(shè)定為參照。用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析和LSD法多重比較，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性由t檢驗得出，顯著性水平為α=0.05。成蟹和扣蟹的不同組織間及幼體不同時期間P<0.05表示為基因表達差異顯著(圖表中用*表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Timeless基因的半定量試驗分析

PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得長度約250 bp的片段，然后回收目的產(chǎn)物，并用引物qTIM-F/qTIM-R對PCR產(chǎn)物進行測序。結(jié)果驗證了該基因的正確性。

2.2 熒光定量試驗分析

經(jīng)熒光定量PCR分析，Timeless基因廣泛地表達于中華絨螯蟹幼體不同的發(fā)育階段以及成蟹、扣蟹的不同組織中。

2.2.1 成蟹、扣蟹不同性別、不同組織間的Timeless基因表達差異分析

以qTIM-F/qTIM-R為目的基因引物，Qβ-actin-F/Qβ-actin-R為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR技術(shù)檢驗中華絨螯蟹Timeless基因在扣蟹和成蟹時期不同性別的眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、性腺、心臟8種組織間的表達情況，結(jié)果見圖1、圖2。以性腺(精巢、卵巢)組織的mRNA表達量為參照，無論是雌蟹還是雄蟹，在扣蟹時期，Timeless基因都是在肝胰腺和肌肉組織中的表達量最高，與其他組織表達均呈顯著差異(P<0.05)，在眼柄、鰓、胃、腸和性腺的表達量次之且相對較為接近，在心臟中的表達量最低。而在成蟹時期，Timeless基因僅在肝胰腺中的表達量最高，與其他各組織表達均呈差異顯著(P<0.05)。且在該時期的雄性個體中，Timeless基因在除肝胰腺外的其他7個組織中表達量接近，而雌性的其他7個組織中表達量則稍微有些差異，但差異不顯著。

值得注意的是扣蟹時期不同性別之間的組織表達無顯著差異(P>0.05)，而成蟹時期Timeless基因在不同性別相同組織間的表達差異顯著：在眼柄組織中，雌蟹Timeless基因表達量明顯高于雄蟹(P<0.001)；而在肌肉、腸、心臟3個組織中，雄蟹的Timeless基因表達量也顯著高于雌性的基因表達量，雌雄個體間肌肉組織中Timeless基因表達存在極顯著差異(P<0.01)，在腸和心臟中表達呈顯著差異(P<0.05)。

圖1 中華絨螯蟹Timeless基因在雌、雄成蟹不同組織中的mRNA表達情況1：眼柄；2：肝胰腺；3：鰓；4：胃；5：肌肉；6：腸；7：性腺(卵巢、精巢)；8：心臟.不同小寫和大寫字母分別表示雌蟹和雄蟹中表達量的差異水平顯著(P<0.05)；內(nèi)參基因：β-actin；n=3；*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001.下同.

圖2 中華絨螯蟹Timeless基因在雌、雄扣蟹不同組織中的mRNA表達情況

2.2.2 Timeless基因在幼體不同發(fā)育階段的表達差異分析

用同樣的引物和方法對中華絨螯蟹Timeless基因在幼體9個發(fā)育時期的mRNA表達情況進行了檢測(圖3)。以溞狀幼體Ⅰ期的基因表達量設(shè)為參照，發(fā)現(xiàn)從溞狀幼體Ⅰ期到溞狀幼體Ⅳ期Timeless基因的表達量基本呈穩(wěn)步上升趨勢，但增幅不大，至溞狀幼體Ⅴ期時表達量突然激增，達到了最高值，與其他發(fā)育時期均呈顯著差異(P<0.05)。然后在大眼幼體時期的表達量又急劇下降，達到最低值，之后在仔蟹時期的表達量又呈穩(wěn)步上升趨勢。

3 討 論

Timeless基因是重要內(nèi)源性的生物鐘基因之一，在生物體內(nèi)周期性表達，對生物節(jié)律、細胞周期、胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療等發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。本研究采用實時熒光定量PCR分析了中華絨螯蟹Timeless基因在幼體不同發(fā)育階段及在扣蟹、成蟹不同性別個體不同組織中的表達情況。

現(xiàn)已證實，多種外周組織如心、肝、腎、骨骼肌，乃至體外培養(yǎng)的細胞中均有生物鐘基因的表達[30-36]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，Timeless基因無論在中華絨螯蟹幼體發(fā)育時期還是在扣蟹、成蟹不同性別個體的眼柄、肝胰腺、鰓、胃等8個不同組織中均有表達，這與Timeless基因在其他動物中的表達情況類似。

圖3 中華絨螯蟹Timeless基因在幼蟹不同發(fā)育時期的mRNA表達情況1：溞狀幼體Ⅰ期；2：溞狀幼體Ⅱ期；3：溞狀幼體Ⅲ期；4：溞狀幼體Ⅳ期；5：溞狀幼體Ⅴ期；6：大眼幼體；7：仔蟹Ⅰ期；8：仔蟹Ⅱ期；9：仔蟹Ⅲ期.

3.1 Timeless基因在成蟹、扣蟹時期的作用

從酵母到人類，生物鐘和能量代謝都存在著緊密的偶聯(lián)關(guān)系[37]，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在扣蟹時期無論是雌性個體還是雄性個體，Timeless基因在肝胰腺組織和肌肉組織中的表達量均較高，在其他幾個組織中表達量較低，到成蟹時期Timeless基因主要在肝胰腺大量表達。眾所周知，肝胰腺是十足目甲殼類動物脂類儲存和脂類加工的主要器官[38-40]，其脂質(zhì)含量高，脂類新陳代謝十分旺盛，是能量提供和代謝的中心，對甲殼動物的生長和發(fā)育以及生殖都有著重要的作用，而Timeless基因在肝胰腺組織中高量表達表明該生物鐘基因在中華絨螯蟹新陳代謝過程中起著十分重要的作用，也表明其參與了中華絨螯蟹的生長和發(fā)育。中華絨螯蟹的扣蟹至成蟹時期是生殖洄游的關(guān)鍵階段，大眼幼體以及尚未性成熟的幼蟹溯河上遷，幼蟹一面上遷，一面不斷地覓食、生長和發(fā)育；幼蟹中一部分侵入江河的支流、溝渠以及湖泊等較淺的水域里生活，另一部分則分散到江河的沿岸帶，并繼續(xù)上遷，一直可持續(xù)到夏季[27]，這需要強有力的肌肉和能量支持。幼蟹在上遷過程中經(jīng)多次脫皮才完全變?yōu)槌尚返男螤畈⑦_到成熟，一般到第二、三年成熟，再洄游到河口交配產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后的親蟹即老死在海中[41]，幼體的上遷完全受其自身新陳代謝的調(diào)控。中華絨螯蟹洄游過程中肌肉收縮、生殖腺生長合成新的物質(zhì)等需要不斷地消耗大量能量，例如上遷過程中，幼蟹要適應(yīng)滲透環(huán)境變化而消耗能量，幼蟹逆流而上爬越閘、壩、堤以及魚柵等多種障礙亦需消耗大量能量。Timeless基因在肝胰腺和肌肉組織中的高量表達說明該時鐘基因在中華絨螯蟹生殖洄游過程中對其運動的調(diào)控起重要作用。另外肌肉與肝胰腺組織一樣是重要的儲能組織，該基因在這兩個組織的高量表達也與這兩個組織的理化性質(zhì)特性相一致。中華絨螯蟹成蟹性成熟后可借助水流，順流而下，赴河口淺海交配生殖[27]，這時期其肌肉受到的選擇壓力大大減少，賈小燕[42]的研究表明，中華絨螯蟹雌性親蟹在生殖洄游過程中主要以脂肪作為供能物質(zhì)，本研究中發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹Timeless基因在成蟹肝胰腺組織中的表達量極顯著高于在其他組織的表達量也進一步表明Timeless基因在肝胰腺供能過程中發(fā)揮重要作用。

3.2 Timeless基因在中華絨螯蟹幼體發(fā)育時期的作用

中華絨螯蟹從胚胎開始至溞狀幼體期都生活在咸淡水中(鹽度約20)，然后在溞狀幼體后期至大眼幼體，幼蟹會從生活鹽度較高的海水逐漸調(diào)節(jié)至淡水環(huán)境生活，在此過程中中華絨螯蟹幼體會經(jīng)過變態(tài)發(fā)育不斷蛻皮生長，在大眼幼體期經(jīng)歷滲透壓生理適應(yīng)，并逐漸適應(yīng)淡水生活。本研究中發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹Timeless基因在幼體9個發(fā)育時期均有表達，且該基因在溞狀幼體前4個時期的表達量相近并呈穩(wěn)步上升趨勢，這些發(fā)育時期間的Timeless基因表達差異顯著，其在溞狀幼體Ⅴ期mRNA表達激增，但在大眼幼體期表達又顯著下降，然后其在仔蟹時期的表達又呈穩(wěn)步上升趨勢。已有研究表明哺乳動物Timeless基因與其生長發(fā)育和細胞發(fā)育周期有關(guān)[9-12,43-44]。其中Xiao等[9]的研究表明，在哺乳動物胚胎發(fā)育時期，Timeless基因的功能高度保守，在器官發(fā)生的初期，該基因廣泛表達于大腦、肺、心臟、肝、胃和尿生殖嵴等器官，同時還發(fā)現(xiàn)Timeless表達水平的動態(tài)變化對肺的發(fā)育是至關(guān)重要的。Li等[10]研究表明，Timeless基因在小鼠上皮形成、腎發(fā)生和其他上皮器官形成中有重要作用。而Liu等[45]在黑腹果蠅中的研究結(jié)果表明，Timeless基因?qū)υ诠壍纳L調(diào)控也起重要的作用，消除該基因?qū)鹂偹叩臏p少及中斷，從而進一步影響果蠅的生長發(fā)育，以及繁殖和存活能力等。這些試驗與本研究都表明Timeless基因在不同物種的幼體發(fā)育時期具有重要的生理調(diào)控性。

3.3 小結(jié)

總之，越來越多試驗證據(jù)表明生物鐘系統(tǒng)在各種生命基本過程起到不可或缺的調(diào)節(jié)作用，其系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因Timeless尤為重要。在本研究中，中華絨螯蟹Timeless基因在不同發(fā)育階段以及性成熟的扣蟹、成蟹不同組織間的這種獨特表達模式，初步表明該基因參與了中華絨螯蟹的幼體生長發(fā)育和細胞發(fā)育及生理適應(yīng)調(diào)控，具體的作用還需要進一步研究驗證。

[1] Hall J C.Tripping along the trail to the molecular mechanisms of biological clocks[J].Trends in Neurosciences,1995,18(5):230-240.

[2] Liu Z,Zhang Y.Timeless gene and biological clock genes[J].Zoological Research,2001,22(6):497-501.

[3] Dunlap J C.Molecular bases for circadian clocks[J].Cell,1999,96(2):271-290.

[4] 王晗.生物鐘生物學(xué)及其研究進展[J].生命科學(xué),2015，27(11):1313-1319.

[5] Stanewsky R.Genetic analysis of the circadian system inDrosophilamelanogasterand mammals[J].Developmental Neurobiology,2003,54(1):111-147.

[6] Konopka R J,Benzer S.Clock mutants ofDrosophilamelanogaster[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1971,68(9):2112-2116.

[7] Song H Y,Zhang Y,Jiang H.Progress on biological function of circadian gene Timeless[J].Letters in Biotechnology,2014,25(3):421-424.

[8] Piccin A,Couchman M,Clayton J D,et al.The clock gene period of the housefly,Muscadomestica,rescues behavioral rhythmicity inDrosophilamelanogaster: evidence for intermolecular coevolution[J].Genetics,2000,154(2):747-758.

[9] Xiao J,Li C,Zhu N L,et al.Timeless in lung morphogenesis[J].Developmental Dynamics,2003,228(1):82-94.

[10] Li Z,Stuart R O,Qiao J,et al.A role for Timeless in epithelial morphogenesis during kidney development[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,97(18):10038-10043.

[11] Engelen E,Janssens R C,Yagita K,et al.Mammalian timeless is involved in period determination and DNA damage-dependent phase advancing of the circadian clock[J].Plos One,2013,8(2): e56623.

[12] Gotter A L,Manganaro T,Weaver D R,et al.A Timeless function for mouse Timeless[J].Nature Neuroscience,2000,3(8):755-756.

[13] Yoshida K,Sato M,Hase T,et al.Timeless is overexpressed in lung cancer and its expression correlates with poor patient survival[J].Cancer Science,2013,104(2):171-177.

[14] Lin Y M,Chang J H,Yeh K T,et al.Disturbance of circadian gene expression in hepatocellular carcinoma[J].Molecular Carcinogenesis,2008,47(12):925-933.

[15] Mazzoccoli G,Panza A,Valvano M R,et al.Clock gene expression levels and relationship with clinical and pathological features in colorectal cancer patients[J].Chronobiology International,2011,28(10):841-851.

[16] Unsal-Kacmaz K,Chastain P D,Qu P P,et al.The human Tim/Tipin complex coordinates an intra-S checkpoint response to UV that slows replication fork displacement[J].Molecular and Cellular Biology,2007,27(8):3131-3142.

[17] Gentile C,Meireles-Filho A C A,Britto C,et al.Cloning and daily expression of the Timeless gene inAedesaegypti(Diptera: Culicidae)[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2006,36(11):878-884.

[18] Danbara Y,Sakamoto T,Uryu O,et al.RNA interference of Timeless gene does not disrupt circadian locomotor rhythms in the cricketGryllusbimaculatus[J].Journal of Insect Physiology,2010,56(12):1738-1745.

[19] Xu L.Timeless is a critical gene in the diapause of silkworm,Bombyxmori[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(73):16594-16601.

[20] Kamae Y,Tomioka K.Timeless is an essential component of the circadian clock in a primitive insect,the firebratThermobiadomestica[J].Journal of Biological Rhythms,2012,27(2):126-134.

[21] Panda S,Hogenesch J B,Kay S A.Circadian rhythms from flies to human[J].Nature,2002,417(6886):329-335.

[22] Hawkins G A,Meyers D A,Bleecker E R,et al.Identification of coding polymorphisms in human circadian rhythm genesPer1,Per2,Per3,Clock,Arntl,Cry1,Cry2 andTimelessin a multi-ethnic screening panel[J].Mitochondrial DNA,2008,19(1):44-49.

[23] 李科華,王慶敏,劉秋紅,等.小鼠外周血白細胞節(jié)律相關(guān)基因cry2,per2,timeless,rev-erb表達的近日節(jié)律性研究[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(3):169-173.

[24] 汪京京.Timeless通過結(jié)合Cry1aa負向調(diào)控斑馬魚生物鐘[D].蘇州：蘇州大學(xué),2015.

[25] Cahill G M.Clock mechanisms in zebrafish[J].Cell and Tissue Research,2002,309(1):27-34.

[26] Anger K.Effects of temperature and salinity on the larval development of the Chinese mitten crabEriocheirsinensis(Decapoda: Grapsidae)[J].Marine Ecology Progress,1991,72(1/2):103-110.

[27] 堵南山.中華絨螯蟹的洄游[J].水產(chǎn)科技情報,2004,31(2):56-57.

[28] Jin X K,Li W W,Cheng L,et al.Two novel short C-type lectin from Chinese mitten crab,Eriocheirsinensis,are induced in response to LPS challenged[J].Fish & Shellfish Immunology,2012,33(5):1149-1158.

[29] Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[30] Panda S,Antoch M P,Miller B H,et al.Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock[J].Cell,2002,109(3):307-320.

[31] Storch K F,Lipan O,Leykin I,et al.Extensive and divergent circadian gene expression in liver and heart[J].Nature,2002,417(6884):78-83.

[32] Kita Y,Shiozawa M,Jin W,et al.Implications of circadian gene expression in kidney,liver and the effects of fasting on pharmacogenomic studies[J].Pharmacogenetics,2002,12(1):55-65.

[33] Ueda H R,Chen W,Adachi A,et al.A transcription factor response element for gene expression during circadian night[J].Nature,2002,418(6897):534-539.

[34] Reilly D F,Westgate E J,Fitzgerald G A.Peripheral circadian clocks in the vasculature[J].Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology,2007,27(8):1694-1705.

[35] Delaunay F,Thisse C,Marchand O,et al.An inherited functional circadian clock in zebrafish embryos[J].Science,2000,289(5477):297-300.

[36] Yamazaki S,Numano R,Abe M,et al.Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats[J].Science,2000,288(5466):682-685.

[37] Redlin U,Nuesslein B,Schmidt I.Circadian changes of brown adipose tissue thermogenesis in juvenile rats[J].American Journal of Physiology,1992,262(2):504-508.

[38] Loizzi R F.Interpretation of crayfish hepatopancreatic function based on fine structural analysis of epithelial cell lines and muscle network[J].Cell and Tissue Research,1971,113(3):420-440.

[39] Vogt G,Storch V,Quinitio E T,et al.Midgut gland as monitor organ for the nutritional value of diets inPenaeusmonodon(Decapoda)[J].Aquaculture,1985,48(1):1-12.

[40] Mikami S,Greenwood J G,Takashima F.Functional morphology and cytology of the phyllosomal digestive system ofIbacusciliatusandPanulirusjaponicus(Decapoda,Scyllaridae and Palinuridae)[J].Crustaceana,1994,67(2):212-225.

[41] 宋大祥.河蟹的生殖[J].生物學(xué)通報,1984(5):13-14.

[42] 賈小燕.中華絨螯蟹雌性親蟹行為、能量代謝及血淋巴生理對鹽度的響應(yīng)研究[D].上海：上海海洋大學(xué),2012.

[43] Ishikawa F.Timeless tunes: replicating happy endings[J].Cell Cycle,2012,11(16):2977-2978.

[45] Liu Z,Zhao Z.Effects of light interruption on sleep and viability ofDrosophilamelanogaster[J].PLoS One,2014,9(8):e105678.