草魚腸道拮抗性芽孢桿菌的凍干保護(hù)劑優(yōu)化研究

張 濤，閆有利

(遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000)

目前，隨著我國淡水漁業(yè)的發(fā)展，高密度集成養(yǎng)殖成為我國淡水漁業(yè)養(yǎng)殖的主要發(fā)展趨勢，而伴隨的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病頻發(fā)，死亡率增大等突出問題，也是水產(chǎn)工作者面臨亟需解決的問題?，F(xiàn)在常用的廣譜抗菌類藥物由于耐藥性[1-6]，藥物殘留導(dǎo)致的環(huán)境污染等副作用嚴(yán)重影響了淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，所以如何尋找一條既可以提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫能力，降低水產(chǎn)動物發(fā)病率和死亡率，又可以降低藥物在長期使用后的不良副作用的途徑勢在必行。

芽孢桿菌(Bacillus)是一種好氧微生物，不僅能夠改善水質(zhì)[7-12]，而且能在腸道中產(chǎn)生生物工程利用價(jià)值極高的脂肽類和肽類抗生素，同時(shí)能產(chǎn)生多種消化酶[13-14]，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫能力[15-16]，并抑制有害細(xì)菌的繁殖，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的健康成長[17]。研究表明，飼料中添加芽孢桿菌能有效改變魚蝦腸道內(nèi)的細(xì)菌種群，從而能顯著提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的非特異性免疫指標(biāo)和消化酶活性，促進(jìn)水產(chǎn)動物健康生長[18-24]。

已有的試驗(yàn)表明，在草魚(Ctenopharyngodonidellus)腸道內(nèi)篩選出抑菌活性很強(qiáng)的芽孢桿菌，并以一定含量攪拌到草魚的飼料中，能提高草魚的生長率，降低草魚的發(fā)病率和死亡率。而如何較好的保存由草魚腸道提取的病原拮抗性芽孢桿菌的活性和穩(wěn)定性的報(bào)道較少。由脫脂乳、海藻糖、甘油、谷氨酸4種組分組成的混合保護(hù)劑可在冷凍干燥中對日本金龜子芽孢桿菌(B.popilliae)的孢子提供最有效的支持和保護(hù),其最佳組合為10%脫脂乳，8%海藻糖，2%甘油，0.2%谷氨酸，在凍干過程中孢子的活性保持率達(dá)到90%以上[25]。筆者通過冷凍干燥方法，設(shè)計(jì)不同保護(hù)劑配方的正交試驗(yàn)，從而篩選出對草魚拮抗性芽孢桿菌保存較好的試驗(yàn)配方，為后期草魚養(yǎng)殖過程中的病害防治和制劑學(xué)研究提供一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚健康無病，采自于遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地。麥芽糊精、海藻糖和甘氨酸來源、性狀等見表1。

表1 試驗(yàn)藥物性狀

1.2 方法

1.2.1 病原拮抗性芽孢桿菌的處理

采用80 ℃水浴法[26]從草魚腸道內(nèi)分離并純化芽孢桿菌，再通過牛津杯法[27]篩選出病原拮抗性芽孢桿菌。將實(shí)驗(yàn)室制得的病原拮抗性芽孢桿菌接種到裝有滅過菌的普通液體培養(yǎng)基的三角瓶中，并在37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)后的菌懸液放入滅菌過的50 mL離心管中，并在4 ℃、6000 r/min的冷凍離心機(jī)中離心6 min后，倒出上清液，留有的沉淀既是擴(kuò)增后的菌體；在沉淀中加入滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，去除上清液；再加入滅菌的15 mL的不同保護(hù)劑溶液(表2～3)，混勻后加入10 mL西林瓶中，每個(gè)西林瓶加入5 mL菌懸液，共3個(gè)平行組；放入-80 ℃冰箱24 h后，移至FD5505冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h，以凍干后菌體存活率為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選病原拮抗性芽孢桿菌凍干保護(hù)劑配方，并以對照組為參照。

凍干條件：將每個(gè)裝有5 mL菌懸液的西林瓶從-80 ℃冰箱拿出后，放至FD5505冷凍干燥機(jī)中，經(jīng)過預(yù)凍后的菌懸液分別進(jìn)行冷凝干燥和解析干燥；第一步冷凝干燥時(shí)，將冷凍干燥箱的前箱隔板溫度設(shè)置為-35 ℃，后箱冷阱溫度設(shè)置為-80 ℃，時(shí)間設(shè)置為25 h，壓力設(shè)置為10 Pa；第二步解析干燥時(shí)，將冷凍干燥箱的前箱隔板溫度設(shè)置為20 ℃，后箱冷阱溫度設(shè)置為-80 ℃，時(shí)間設(shè)置為23 h，壓力設(shè)置為10 Pa。冷凝干燥和解析干燥結(jié)束后，對每個(gè)西林瓶進(jìn)行手動壓蓋，即制成菌體凍干品。

凍干后菌體成活率：凍干后的菌體用5 mL蒸餾水加入10 mL西林瓶中復(fù)溶，并采用平板菌落計(jì)數(shù)法[28]，分別記錄菌體凍干前后的菌體數(shù)，并通過1.3中的公式計(jì)算凍干后菌體成活率。

設(shè)置麥芽糊精、甘氨酸和海藻糖3個(gè)變量因素，采用三因素三水平(表2)，即L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)選病原拮抗性芽孢桿菌凍干保護(hù)劑最佳配比含量，每組試驗(yàn)設(shè)定3個(gè)平行組。

表2 因素水平表

1.2.2 菌體穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)上述正交試驗(yàn)測試結(jié)果，篩選出菌體成活率較高的兩組凍干保護(hù)劑配方，分別將實(shí)驗(yàn)室制得的菌體加入篩選出的凍干保護(hù)劑后(方法同1.2.1)，經(jīng)過冷凍干燥放在4 ℃冰箱中保存，在分別測試1、3、5、7、9、12個(gè)月后的菌體成活率，每組3個(gè)平行(表5～6)。菌體成活率測試方法與1.2.1相同。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析

記錄凍干后菌體成活率，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 15.0在α=0.05水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進(jìn)行組間兩兩比較和顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，并采用層次分析法統(tǒng)計(jì)正交試驗(yàn)結(jié)果[29]。

式中，S為菌體成活率，S1為菌體凍干前菌群數(shù)量(cfu/mL)，S2為菌體凍干后菌群數(shù)量(cfu/mL)。

2 結(jié)果與分析

以凍干后菌體存活率為考察指標(biāo)時(shí)，極差R值大小顯示各因素對菌體存活率作用影響為A>B>C(表3)。其中，B、C因素R值<空列組R值，說明A因素對凍干后菌體存活率作用最重要；其中，A1B3C3的凍干保護(hù)劑配方對菌體存活率高達(dá)(93.30±2.21)%，高于A1B1C1和A2B1C2的凍干保護(hù)劑配方對菌體存活率，但不顯著(P>0.05)，顯著高于其他凍干保護(hù)劑配方對菌體的存活率(P<0.05)。

表3 菌體凍干保存試驗(yàn)測定結(jié)果

注：同列中標(biāo)有不同字母的平均值之間有顯著性差異(P<0.05).

方差分析表明各因素?zé)o顯著差異(P>0.05)(表4)。從正交試驗(yàn)(表3)和方差分析(表4)綜合結(jié)果可知，以凍干后菌體存活率為考察指標(biāo)時(shí)，菌體凍干保護(hù)劑最佳配方為A1B1C3。由正交試驗(yàn)(表3)和方差分析(表4)綜合結(jié)果中，篩選出2種凍干保護(hù)劑配方(表5)。

表4 菌體凍干后成活率方差分析結(jié)果

表5 菌體凍干保存劑的篩選配方

在經(jīng)過12個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)(表6)可知，A1B1C3的凍干保護(hù)劑配方對菌體存活率高于A1B3C3的凍干保護(hù)劑配方對菌體存活率，但不顯著(P>0.05)。

綜合上述正交試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分析，A1B1C3的凍干保護(hù)劑配方可以有效的保護(hù)菌體的成活；在經(jīng)過12個(gè)月后，仍然可以使菌體達(dá)到80%以上的存活率，基本達(dá)到了益生菌經(jīng)過長期保存而不失活的目的。

表6 菌體凍干后穩(wěn)定性試驗(yàn)

注：同列中標(biāo)有不同字母的平均值之間有顯著性差異(P<0.05).

3 討 論

目前，我國關(guān)于芽孢桿菌在淡水漁業(yè)養(yǎng)殖上的應(yīng)用報(bào)道較多[30-33]。這些報(bào)道表明，芽孢桿菌不僅具有改善水質(zhì)的能力，而且能夠有效改變水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的腸道細(xì)菌種群，抑制有害細(xì)菌的產(chǎn)生，從而提高了水生動物的防病能力；而如何能在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用過程中保存其生物活性和穩(wěn)定性是芽孢桿菌提取和保存工藝的重要一環(huán)。

本試驗(yàn)采用冷凍干燥的方法保存病原拮抗性芽孢桿菌，與其他方法比較，主要有以下幾方面優(yōu)勢：(1)芽孢桿菌屬于原核細(xì)胞型微生物，對溫度比較敏感，在高溫條件下易繁殖、老化和死亡；而在低溫干燥條件下，芽孢桿菌其生物活性損失較少。(2)芽孢桿菌屬于好氧微生物，在真空干燥條件下，環(huán)境的氧氣極少，芽孢桿菌處于休眠狀態(tài)，不易繁殖，其生物活性可以得到有效保護(hù)。(3)冷凍干燥法可以去除菌懸液95%～99%的水分，并保持芽孢桿菌生物活性的穩(wěn)定性，從而便于其運(yùn)輸和長期保存。

微生物凍干燥過程中賦形劑的選擇是決定冷凍干燥能否成功的關(guān)鍵因素。目前，根據(jù)化學(xué)性質(zhì)，微生物凍干賦形劑有單糖(葡頭糖、半乳糖等)、二糖(乳糖、海藻糖等)和多糖類(糊精、淀粉等)，多元醇類保護(hù)劑(甘油、甘露醇等)、氨基酸類保護(hù)劑(甘氨酸、色氨酸等)、蛋白質(zhì)和多肽類保護(hù)劑(生長因子、激素等)以及聚合物類保護(hù)劑(牛血清白蛋白、麥芽糊精等)[34]。

為防止凍干過程中芽孢桿菌生物活性的損失，本試驗(yàn)選取了海藻糖、麥芽糊精和甘氨酸作為芽孢桿菌的凍干賦形劑，其主要依據(jù)以下幾方面因素[35]：(1)與單糖、多糖和還原性二糖比較，海藻糖屬于非還原二糖，不存在與凍干品發(fā)生還原性Mailard反應(yīng)；同時(shí)，海藻糖作為二糖能在凍結(jié)過程中更好的起到低溫保護(hù)劑的作用，并在干燥脫水過程中起到脫水保護(hù)劑的作用。(2)與多元醇類、多肽類及其他聚合物賦形劑比較，麥芽糊精作為一種聚合物賦形劑成本較低，在冷凍干燥過程中，其優(yōu)先析出，具有一定的表面活性，并在細(xì)菌分子之間產(chǎn)生“位阻”作用，從而減少芽孢桿菌的生物活性損失；同時(shí)，麥芽糊精能更好的提高菌懸液水溶液黏度，提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，抑制小分子賦形劑海藻糖的結(jié)晶和pH值的降低；在微生物冷凍干燥過程中，麥芽糊精在凍結(jié)過程和脫水過程中都能提供更好的有效保護(hù)作用。(3)筆者在前期試驗(yàn)篩選氨基酸類凍干賦形劑發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌在快速凍結(jié)過程中，甘氨酸作為氨基酸類凍干賦形劑，能夠更有效的抑制菌懸液的pH值變化，減少了芽孢桿菌生物活性的損失。(4)聚合物凍干保護(hù)劑一般不單獨(dú)使用，當(dāng)麥芽糊精作為一種聚合物保護(hù)劑與糖類或氨基酸類物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)，可以與蛋白質(zhì)物質(zhì)形成很強(qiáng)的氫鍵作用，更好的保證了凍干微生物的穩(wěn)定性。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果和幾方面因素分析，芽孢桿菌的生物活性總體趨勢與時(shí)間有一定關(guān)系，時(shí)間越長，生物活性越低，說明這3種賦形劑對微生物細(xì)菌凍干粉活性影響隨著時(shí)間的增長會逐漸降低，從而影響到芽孢桿菌生物活性穩(wěn)定性。3種賦形劑對芽孢桿菌生物活性影響依次為麥芽糊精>甘氨酸>海藻糖，各賦形劑差異雖不顯著(P>0.05)，但海藻糖、甘氨酸并不是起主要作用的賦形劑，這說明聚合物類的賦形劑保護(hù)功能強(qiáng)于低聚糖及氨基酸類賦形劑。上述3種賦形劑的正交試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以凍干后菌體成活率為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，3種賦形劑最佳配方為A1B1C3。

通過試驗(yàn)篩選出的病原拮抗性芽孢桿菌保存配方A1B1C3，即2%麥芽糊精，0.5%甘氨酸，6%海藻糖，經(jīng)過12個(gè)月保存后，其生物活性仍然超過80%，為后期草魚養(yǎng)殖過程中的病害防治，減少魚體發(fā)病和死亡率起到了保駕護(hù)航的作用。

[1] Claude E B,Laurence M．Risks associated with the use of chemicals in pond aquaculture[J]．Aquacultural Engineering ,1999,20(2):113-124.

[2] 張林中.耐藥性產(chǎn)生的原因及控制措施[J].漁業(yè)致富指南，2011(23):64.

[3] 張俊楠.水產(chǎn)用抗菌藥物耐藥性的相關(guān)研究進(jìn)展[J].江西水產(chǎn)科技，2017(2):33-34.

[4] 蔡麗娟,許寶青,林啟存等.水產(chǎn)致病性嗜水氣單胞菌耐藥性比較與分析[J].水產(chǎn)科學(xué)，2011,30(1):42-45.

[5] 林璐明,蘇躍朋.水產(chǎn)抗生素類藥物的耐藥性機(jī)制及合理應(yīng)用[J].河北漁業(yè)，2009(5):42-43.

[6] 王瑞旋,陳畢生.喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究概況[J].南方水產(chǎn)，2007,3(3):73-79.

[7] Lalloo R,Ramchuran S,Ramduth D,et al.Isolation and selection of Bacillus spp.as potential biological agents for enhancement of water quality in culture of ornamental fish [J].J Appl Microbiol,2007,103(5):1471-1479.

[8] 李衛(wèi)芬,鄧斌,陳南南，等.芽孢桿菌對草魚生長和腸粘膜抗氧化功能及養(yǎng)殖水質(zhì)的影響[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2012,33(1):65-70.

[9] 羅勇勝,李卓佳,楊鶯鶯，等.光合細(xì)菌與芽孢桿菌協(xié)同凈化養(yǎng)殖水體的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006,25(增刊):206-210.

[10] 陳芳，楊代勤，蘇應(yīng)兵，等.芽孢桿菌對黃鱔養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響[J].養(yǎng)殖與飼料，2008(6):83-85.

[11] 宋學(xué)宏,耿英慧,楊彩根，等.一種生物凈水劑對河蟹養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化效果研究[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2009,30(6):89-93.

[12] 張峰峰,謝鳳行,趙玉潔，等.枯草芽孢桿菌水質(zhì)凈化作用的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2009,24(4):218-221.

[13] Popova Z P，Nikonorova A K．A new probiotic for animal husban [J]．Zootekhniya，1995(11):21-22.

[14] 張德強(qiáng)，關(guān)曉燕.枯草芽孢桿菌株B2的生長特性及其對仿刺參的益生特性[J].水產(chǎn)科學(xué)，2016,35(3):234-238.

[15] 華雪銘,周洪琪,張冬青,等.多糖和益生菌對暗紋東方鲀免疫功能的調(diào)節(jié)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2006,30(2):230-235.

[16] 劉慧玲,黃翔鵠,李長玲,等.不同濃度的枯草芽孢桿菌對羅非魚魚苗的養(yǎng)殖水體水質(zhì)及其抗病能力的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2009,30(10):5-9.

[17] Capkin E,Altinok I.Effects of dietary probiotic supplementations on prevention/treatment of yersiniosis disease [J].Journal of Applied Microbiology,2009,106(4):1147-1153.

[18] 沈文英,傅玲琳,李衛(wèi)芬.枯草芽孢桿菌表達(dá)的VP28對南美白對蝦免疫力和抗病毒感染的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2012,36(2):375-378.

[19] Kummar R,Mukherjee S C,Prasad K P,et al.Evaluation ofBacillussubtilisas a probiotic to Indian major carpLabeorohita[J].Aquaculture Research,2006,37(12):1215-1221.

[20] Aly S M,Ahmed Y A G,Aharrrb A A A,et al.Studies onBacillussubtilisandLactobacillusacidophilus,as potential probiotics,on immune response and resistance of tilapia nilotica (Oreochriomisniloticus) to challenge infections [J].Fish & Shellfish Immunology,2008,25(1/2):128-136.

[21] Ai Q,Xu H,Mai K,et al.Effect of dietary supplementation ofBacillussubtilisand fructooligosaccharide on growth performance,survival,non-specific immune response and disease resistance of juvenile yellow croaker,Larimichthyscrocea[J].Aquaculture,2011,317(1/4):155-161.

[22] Shen W Y,Fu L L,Li W F,et al.Effect of dietary supplementation withBacillussubtilison the growth,performance,immune response and antioxidant activities of the shrimps (Litopenaeusvannamei) [J].Aquaculture Research,2010,41(11):1691-1698.

[23] 丁賢,李卓佳,陳永青,等.芽孢桿菌對凡納對蝦生長和消化酶活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2004,11(6):580-584.

[24] 江永明，付天璽，張麗，等.微生物制劑對奧尼羅非魚生長及消化酶活性的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2011,36(6):998-1004.

[25] 李石.體外培養(yǎng)的日本金龜子芽孢桿菌的回收及冷凍干燥保護(hù)劑的研究[D].天津:天津大學(xué),2011.

[26] 周金敏，吳志新，曾令兵，等.黃顙魚腸道病原拮抗性芽孢桿菌的篩選與特性研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2012,36(1):78-84.

[27] Hjelm M,Bergh O,Riaza A,et al.Selection and identification of autochthonous potential probiotic bacteria from turbot larvae (Scophthalmusmaximus) rearing units[J].Systematic and Applied Microbiology,2004,27(3):360-371.

[28] 沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].3版.北京:高等教育出版社,1996:92-95.

[29] 郭穗勛，黃榕波．正交試驗(yàn)層次分析法[J]．大學(xué)數(shù)學(xué)，2004，20(1)：114-117．

[30] 沈斌乾，陳建明，郭建林，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對青魚生長、消化酶活性和魚體組成的影響[J].水生生物學(xué)報(bào)，2013,37(1):48-53.

[31] 程遠(yuǎn)，黃凱，黃秀蕓，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對吉富羅非魚幼魚生長性能、免疫力和抗氧化功能的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26(6):1503-1512.

[32] 李衛(wèi)芬，張小平，宋文輝，等.養(yǎng)殖水體中添加芽孢桿菌對草魚免疫和抗氧化功能的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2012，19(6):1027-1033.

[33] 白亞榮.一種微生態(tài)制劑對鯽魚養(yǎng)殖水化學(xué)指標(biāo)的影響[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)2014(2):9-11.

[34] 于永翔.海水養(yǎng)殖中常見病原菌凍干保護(hù)劑配方與凍干工藝研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2014.

[35] 華澤釗，劉寶林，左建國．藥品和食品的冷凍干燥[M]．北京:科學(xué)出版社,2007.