動(dòng)物克隆史：從克隆蛙到克隆猴

付國(guó)斌 曹敏

2017

年11月27日，世界上首個(gè)體細(xì)胞克隆猴“中中”在中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心的非人靈長(zhǎng)類平臺(tái)誕生；12月5日，第二個(gè)克隆猴“華華”誕生。該項(xiàng)成果于2018年1月25日作為封面文章在線發(fā)表在生物學(xué)頂尖學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》上。這標(biāo)志中國(guó)率先開(kāi)啟了以體細(xì)胞克隆猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的新時(shí)代，實(shí)現(xiàn)了中國(guó)在非人靈長(zhǎng)類研究領(lǐng)域由國(guó)際“并跑”到“領(lǐng)跑”的轉(zhuǎn)變。

含義日漸豐富的克隆

克隆是指創(chuàng)造出一個(gè)與原來(lái)生物體擁有一模一樣遺傳信息的生物體。它原本是指基因的復(fù)制，而現(xiàn)在用處廣泛，早已超出這個(gè)含義。此概念的內(nèi)涵和外延即便是在生物學(xué)界也不盡相同，克隆在分子生物學(xué)上主要是指DNA的復(fù)制，在細(xì)胞學(xué)上指培養(yǎng)一群同基因組的細(xì)胞，在動(dòng)物學(xué)上指獲得同基因組的生物個(gè)體。

雖然高等動(dòng)物普遍采用有性生殖，但克隆是否在高等生物中自然存在呢？答案是肯定的，例如同卵雙胞胎，源自同一個(gè)受精卵的分裂，具有同樣的基因組。這也是人工克隆動(dòng)物的一個(gè)思路，將早期胚胎分為多個(gè)小的胚胎，然后再分別發(fā)育成多個(gè)個(gè)體。這種方式建立在早期胚胎細(xì)胞的可塑性（Plasticity）上，此時(shí)細(xì)胞的命運(yùn)依然可逆并具有全能性。而后期細(xì)胞，特別是已成熟的細(xì)胞并不具有這種特性。采用這種方式不僅在技術(shù)上困難，更為重要的是因?yàn)楸仨氂迷缙谂咛?，所以極大地限制了克隆技術(shù)的使用范圍。

很多特性必須要等到個(gè)體成熟后才能獲知，而如果此時(shí)再想克隆個(gè)體就需要換種思路：采用體細(xì)胞核移植（Somatic cell nuclear transfer， 簡(jiǎn)稱SCNT）技術(shù)。由于動(dòng)物個(gè)體的很多特征由基因控制，因此只要將基因組所在的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞或早期胚胎細(xì)胞中，再進(jìn)一步發(fā)育，即可獲得和被移植個(gè)體同特征的個(gè)體。狹義上的動(dòng)物克隆就是指使用體細(xì)胞核移植技術(shù)的克隆，目前大多數(shù)動(dòng)物克隆都采用這種方式。

動(dòng)物克隆的簡(jiǎn)單歷程

得益于20世紀(jì)上半葉發(fā)育學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，1952年，美國(guó)科學(xué)家羅伯特·布里格斯（Robert Briggs）和托馬斯·金（Thomas King）將青蛙受精卵的細(xì)胞核移植到卵細(xì)胞中并發(fā)育出胚胎。這是人類第一次用細(xì)胞核移植技術(shù)成功發(fā)育出胚胎，這次實(shí)驗(yàn)成功地進(jìn)行了104次核移植，培育出35個(gè)胚胎，其中27個(gè)成長(zhǎng)為蝌蚪。這種發(fā)育成功率在普通人看來(lái)可能很低，但在克隆界算是很高了，簡(jiǎn)直是高出了天際。

當(dāng)然，這與實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物及細(xì)胞有關(guān)。首先，青蛙體外排卵，卵細(xì)胞體積大，非常便于實(shí)驗(yàn)操作。其次，細(xì)胞核來(lái)源于受精卵，本身具有發(fā)育成胚胎并長(zhǎng)成個(gè)體的能力。最后，青蛙受精卵在水中能成長(zhǎng)發(fā)育，要求比較低。雖然實(shí)驗(yàn)看起來(lái)采取了特殊的模式，但依然意義非凡。因?yàn)榧幢憬袢杖祟愐廊徊磺宄?xì)胞核的取出和移植對(duì)細(xì)胞有怎樣的影響，但這次實(shí)驗(yàn)成功了，從結(jié)果上肯定了技術(shù)的可行性，為動(dòng)物克隆開(kāi)創(chuàng)了一片天地。

雖然青蛙克隆實(shí)驗(yàn)成功了，但人們的好奇心并不會(huì)因此而減弱，相反會(huì)變得更強(qiáng)，其中最重要的兩個(gè)疑問(wèn)是：成熟的體細(xì)胞核能否移植并發(fā)育，其他動(dòng)物能否被克隆。

1958年，第一個(gè)問(wèn)題便有了答案。英國(guó)牛津大學(xué)的科學(xué)家約翰·戈登（John Gurdon）成功地將蝌蚪腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移植到青蛙卵細(xì)胞里，并發(fā)育出胚胎。在肯定了第一個(gè)問(wèn)題后，第二個(gè)問(wèn)題的答案也沒(méi)有讓人們等太久。1963年，中國(guó)科學(xué)家童第周在世界上第一次成功克隆了亞洲鯉魚(yú)，這次克隆是將一條雄性鯉魚(yú)的細(xì)胞核移植到雌性鯉魚(yú)的卵母細(xì)胞中。此外，1973年童第周還將亞洲鯉魚(yú)的基因移植到歐洲鯽魚(yú)中，第一次實(shí)現(xiàn)了種間克隆。

高等動(dòng)物羊、鼠和牛的克隆，分別發(fā)生在1984年、1986年和1994年，但由于它們都使用胚胎分裂技術(shù)，而非使用成熟的體細(xì)胞，影響力較小，沒(méi)有受到很大關(guān)注。但很快克隆技術(shù)便受到了前所未有的關(guān)注，讓這個(gè)專業(yè)詞匯從生物學(xué)走進(jìn)了普通公眾，甚至走進(jìn)了科幻電影里。這就是1996年英國(guó)科學(xué)家基思·坎貝爾（Keith Campbell）和伊恩·威爾穆特（Ian Wilmut）用成熟體細(xì)胞成功克隆了一只羊，它的名字叫“多莉”（Dolly）。

多莉一出生便名揚(yáng)世界，它應(yīng)該是迄今為止世界上最有名的動(dòng)物，即便死后知名度依然不減。在經(jīng)歷277次核移植，產(chǎn)生29個(gè)胚胎，放入13個(gè)代孕母羊后，最后有且只有多莉幸運(yùn)地出生了。多莉有3個(gè)母親，分別為它提供細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和子宮。多莉只活了6年多，于2003年去世，共有3次生育，產(chǎn)生6個(gè)后代。

科研成果能夠在第一時(shí)間引起大眾關(guān)注的并不多，引起大眾關(guān)注并且有真正重大突破的可能還要再少一個(gè)數(shù)量級(jí)，而多莉絕對(duì)算是其中最亮眼的科學(xué)事件之一。它不僅第一時(shí)間登上了各大新聞版面，還給克隆界注入了迄今為止最為強(qiáng)勁的強(qiáng)心劑。多莉的誕生證明了克隆高等動(dòng)物的可行性，并且可以正常生活和生育。從此之后，多種高等動(dòng)物如雨后春筍般被克隆成功。

目前，已被克隆的高等物種有20多種，其中克隆牛和鼠誕生于1997年，和人類相近的獼猴在1999年被科學(xué)家利用胚胎分離的方式克隆成功，克隆豬出現(xiàn)于2000年，克隆兔、騾子、鹿和馬則在2003年成功，克隆狗、果蠅在2005年誕生，克隆駱駝?dòng)?009年在迪拜誕生。

近幾年來(lái)，隨著科學(xué)的發(fā)展，克隆的應(yīng)用更加廣泛并開(kāi)始走向商業(yè)。2009年，一種已滅絕的庇里牛斯山羊（Pyrenean ibex）被克隆成功，這是人類第一次將已滅絕的物種克隆出來(lái)。雖然它僅活了7分鐘，但為滅絕動(dòng)物的再生打開(kāi)了一扇亮窗。

克隆猴子的誕生

在成功克隆猴之前，中科院研究人員嘗試了不同的方法，均告失敗，但只有一種方法最終奏效。在克隆猴子的過(guò)程中，有四個(gè)關(guān)鍵性的節(jié)點(diǎn)：胚胎構(gòu)建、卵細(xì)胞激活、核基因啟動(dòng)、著床后發(fā)育。如何攻克這四個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)于研究人員來(lái)說(shuō)也是極大的挑戰(zhàn)。研究顯示，已分化的猴細(xì)胞核對(duì)體細(xì)胞核移植技術(shù)有抗性，因此在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后，引入表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，打開(kāi)或關(guān)閉抑制胚胎發(fā)育的基因。

在這項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)：一組是利用胎兒纖維組織母細(xì)胞，作為融合細(xì)胞的細(xì)胞核來(lái)源，這些細(xì)胞來(lái)自流產(chǎn)幼猴的組織；另一組實(shí)驗(yàn)，利用成年猴子的卵丘細(xì)胞作為融合細(xì)胞的細(xì)胞核來(lái)源。

兩組實(shí)驗(yàn)取得了不同的結(jié)果：在第一組實(shí)驗(yàn)中，21只代孕母猴中的6只成功懷孕，最終生下了2只健康的猴子，它們就是“中中”和“華華”；另一組研究，42只代孕母猴中有22只成功懷孕，最后也有兩只猴子出生，可惜的是，它們短暫存活后死亡。

上文提到在1999年已有獼猴被克隆成功，只不過(guò)它的誕生是通過(guò)胚胎分裂的方法，即胚胎發(fā)育到8細(xì)胞時(shí)，人為地被分為2個(gè)4細(xì)胞的胚胎，再分別發(fā)育。該方法并非使用常規(guī)的動(dòng)物克隆技術(shù)——體細(xì)胞核移植進(jìn)行，因此，無(wú)論從科學(xué)意義還是實(shí)用性上，都比較受限。

而此次中科院神經(jīng)所的工作系通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆猴子，難度更大。為建立體細(xì)胞核移植技術(shù)的流程，快速而精準(zhǔn)地從卵細(xì)胞中取出細(xì)胞核，并促使體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合，該項(xiàng)研究論文的第一作者劉真博士花了3年時(shí)間練習(xí)以及優(yōu)化該流程。最終在表觀遺傳因子的刺激下，重新激活被抑制的基因，大大提高了胚胎發(fā)育的效率和代孕母猴成功懷孕的比例。

克隆猴問(wèn)世的意義

體細(xì)胞克隆猴的成功將推動(dòng)中國(guó)率先發(fā)展出基于非人靈長(zhǎng)類疾病動(dòng)物模型的全新醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)針對(duì)阿爾茨海默病、自閉癥等腦疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進(jìn)程，同時(shí)也讓中國(guó)成為世界腦科學(xué)人才的匯聚高地。

理想的動(dòng)物模型是人類探究疾病、進(jìn)行基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)的重要工具。一直以來(lái)，科學(xué)家孜孜不倦地追求理想的動(dòng)物模型，尤其是對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的構(gòu)建。有關(guān)靈長(zhǎng)類的很多研究問(wèn)題，都可以通過(guò)這一技術(shù)構(gòu)建的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型得到解答。長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，靈長(zhǎng)類動(dòng)物做疾病模型優(yōu)勢(shì)巨大。目前很多疾病的分析方法還沒(méi)有完全在靈長(zhǎng)類模型上成熟應(yīng)用，不過(guò)這也是時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的問(wèn)題。研究靈長(zhǎng)類和研究人類有很多相似性，由于能收割猴的組織直接分析，從而會(huì)協(xié)助和建立無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)方法用于臨床，意義重大。

克隆人距離我們到底還有多遠(yuǎn)

自從克隆羊多莉誕生之后，最近20年克隆技術(shù)的發(fā)展越來(lái)越快，多種動(dòng)物相繼被克隆成功。而人類同它們并沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別。此時(shí)，大眾關(guān)心的另一個(gè)核心問(wèn)題就是：克隆人距離我們到底還有多遠(yuǎn)。

克隆技術(shù)說(shuō)起來(lái)并不復(fù)雜，將細(xì)胞核轉(zhuǎn)入到卵母或胚胎細(xì)胞質(zhì)中，然后即可像受精卵一樣發(fā)育。然而即便已探索了一個(gè)多世紀(jì)，這其中的基本問(wèn)題依然很多，例如去核過(guò)程對(duì)細(xì)胞有什么影響、被移植的細(xì)胞核在進(jìn)入胚胎細(xì)胞質(zhì)之后發(fā)生了什么、克隆的成功率和這些操作有沒(méi)有關(guān)系、如何讓受精卵在體外更好地發(fā)育等。這些問(wèn)題的解決，還需要廣大科研人員的努力，而且目前看起來(lái)并不會(huì)輕松。

人類距離克隆人，也許只有一個(gè)玻璃窗的距離，但社會(huì)輿論、倫理道德和法律禁止任何人向前踏出這一步。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物克隆研究可接受的操作是什么？不可接受的操作是什么？面對(duì)此類問(wèn)題，我們清晰地意識(shí)到，未來(lái)在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究中，科學(xué)家還應(yīng)嚴(yán)格地遵循倫理準(zhǔn)則。

（作者單位為山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院）