基于小鼠脊髓背側(cè)半切損傷模型的小膠質(zhì)細胞激活情況的觀察

高忠文，鄒小麗，張伯寅，蔡 軍，朱慶三*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長春130033；2.University of Louisville,pediatrics,KY,USA)

脊髓損傷是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷，常導(dǎo)致災(zāi)難性的神經(jīng)功能障礙，治療恢復(fù)手段十分有限，預(yù)后不佳。脊髓損傷的病理過程一般被分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷主要與受傷原因和暴力嚴(yán)重程度有關(guān)，損傷過程主要發(fā)生在暴力發(fā)生的瞬間或是之后幾秒內(nèi)，所以干預(yù)的機會和手段十分有限[1]。繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷因素的基礎(chǔ)上發(fā)生局部出血，細胞壞死，細胞內(nèi)酶類釋放，自由基的生成等所導(dǎo)致局部內(nèi)環(huán)境的紊亂，組織破壞，主要包括炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細胞死亡、軸突脫髓鞘、膠質(zhì)瘢痕形成等過程，繼發(fā)性損傷往往更大程度上決定著脊髓損傷患者的預(yù)后水平[2]。炎癥反應(yīng)是決定神經(jīng)功能恢復(fù)水平的最重要因素之一，脊髓局部的炎癥細胞主要由外來侵入的單核巨噬細胞和局部定居的小膠質(zhì)細胞組成。在亞急性期和慢性期，隨著血腦屏障的重新建立和局部組織的修復(fù)，外來細胞難以進入脊髓組織，局部炎癥反應(yīng)主要由小膠質(zhì)細胞完成。當(dāng)前對炎癥反應(yīng)在脊髓損傷中作用的基本共識認為，小膠質(zhì)細胞在發(fā)揮吞噬細菌、碎片的有利作用的同時，又具有持續(xù)的組織破壞作用。所以，調(diào)控脊髓損傷后的小膠質(zhì)細胞激活水平，控制局部組織相關(guān)炎癥因子的釋放是減輕脊髓繼發(fā)性損傷，促進神經(jīng)功能恢復(fù)的重要研究方向和治療目標(biāo)。本研究采用脊髓背側(cè)半切損傷的小鼠模型觀察局部小膠質(zhì)細胞激活和相關(guān)炎癥因子的合成情況。

1 材料與方法

1.1試驗動物和分組

本試驗研究對象采用的是C57BL/6品系野生型Wt小鼠，小鼠均來自于美國Louisville大學(xué)蔡軍博士實驗室提供(6-7周齡,20-24 g)。每組小鼠雌雄數(shù)量相當(dāng)，試驗動物分為兩組，損傷組和對照組。分別在術(shù)后4,7,14,35，42天作為觀察點取材，每個時間點實驗動物不少于6只，中途死亡需另外補全。

1.2動物模型的制作

麻醉生效后，小鼠取俯臥位，頸后部剃毛，定位頸項部上下方最突起點即為C3和T2棘突，取正中切口1.5-2.0 cm，仔細剝離從C3至T2頸椎椎板上附著的肌肉等軟組織。自T2棘突向上查數(shù)棘突，定位目標(biāo)節(jié)段C5-6節(jié)段，微型剪刀輕輕水平剪開硬膜，顯露脊髓。將小鼠固定到脊髓切割裝置LISA上，在顯微鏡下微調(diào)刀刃，輕輕接觸脊髓表面，刀刃對脊髓進行高頻擺動切割(100-150次/s，擺幅5度)，切割深度0.70 mm。切口整齊為合格，依次縫合皮下，皮膚組織，術(shù)后給與腹腔注射1 ml 0.9%生理鹽水補液，隨后置小鼠于保溫毯上麻醉復(fù)蘇。損傷組小鼠腹腔內(nèi)注射0.9%生理鹽水，1 ml/次，2次/每日，術(shù)后常規(guī)護理1周。對試驗動物的處理均依照Louisville大學(xué)研究資源中心的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.3主要試驗和藥品

GFAP(1∶500，rabbit，Abcam)，CD68(1∶50，rat，Abcam)，GFAP(1∶200，mouse，igG1，Santa Cruz)，IL-6(1∶2 000，mouse，Cell Signaling)，OCT (Sakura Finetek,USA)，β- Actin(1∶1500，rabbit，Santa Cruz)。

1.4檢測方法和指標(biāo)

分別在術(shù)后4，7,14,42天收集新鮮脊髓標(biāo)本，主要步驟為小鼠全麻生效后，打開胸腔，經(jīng)左心室穿刺灌流0.9%生理鹽水10-15 ml，切取頸段脊柱，打開椎管，以C5-6為中心截取脊髓，上下各保留0.5 mm，將脊髓組織置于液氮中快速冰凍留存?zhèn)溆?。采?Western Blot 的方法檢測兩組標(biāo)本不同時間點 IL-6的合成水平。

分別在術(shù)后4，7,14,35天收取新鮮脊髓標(biāo)本，主要步驟為小鼠全麻生效后，打開胸腔，經(jīng)左心室穿刺灌流0.9%生理鹽水10-15 ml，繼續(xù)4%多聚福爾馬林液(4% PFA)灌流固定。灌流完畢后，切取頸段脊柱，在顯微鏡下剪開椎板，打開椎管，以損傷處為中心截取完整脊髓組織2.0cm，對照組同樣截取同等大小脊髓組織。將標(biāo)本置于30-40 ml 4%PFA中浸泡過夜，第二日換到20%蔗糖液(20% sucrose buffer)中脫水過夜，采用OCT包埋，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗所獲取數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進行統(tǒng)計，利用SPSS17.0 軟件和IMAGE圖像處理軟件進行統(tǒng)計分析處理，所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P值<0.05代表統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1脊髓損傷局部小膠質(zhì)細胞激活情況的觀察

脊髓損傷區(qū)域可見明顯CD68+染色細胞，CD68是小膠質(zhì)細胞激活的特異標(biāo)志物，可以反映小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)。在術(shù)后第4天，可見脊髓組織開放缺損，缺損中心可見明顯的CD68+小膠質(zhì)細胞激活；在術(shù)后第7天，脊髓組織缺損被閉合，組織有效修復(fù)，損傷區(qū)域周圍可見更多的小膠質(zhì)細胞激活，周圍區(qū)域內(nèi)小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出向損傷中心遷移聚集的趨勢；在術(shù)后第14天，損傷區(qū)域為中心的脊髓組織內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活數(shù)量達到峰值水平；在術(shù)后第35天，小膠質(zhì)細胞的激活已經(jīng)減弱，但是仍有部分處于激活狀態(tài)。見圖1。

圖1脊髓損傷局部CD68+小膠質(zhì)細胞激活情況(A-D分別為術(shù)后4，7，14，35天，CD68為綠色熒光標(biāo)記，藍色為細胞核DAPI染色)

2.2脊髓損傷局部組織內(nèi)IL-6的表達情況

Western Blot的結(jié)果顯示：損傷組脊髓損傷后組織內(nèi)的IL-6的合成較對照組增強；術(shù)后第7天(7dpi)，IL-6的合成明顯升高；術(shù)后第42天(42dpi)，IL-6水平已經(jīng)明顯下降，但是仍然高于對照組水平(P<0.05)。見圖2。

3 討論

在脊髓損傷過程中，隨著血腦屏障的破壞，血液循環(huán)中的單核巨噬細胞侵入到損傷區(qū)域，和局部定居的小膠質(zhì)細胞共同在繼發(fā)性損傷中發(fā)揮著重要的作用。研究結(jié)果顯示，在脊髓損傷發(fā)生12-24小時之后，小膠質(zhì)細胞和外來單核巨噬細胞快速激活出現(xiàn)在脊髓損傷區(qū)域；在傷后4-8天時，損傷區(qū)域炎癥細胞的數(shù)量達到高峰，隨后緩慢下降并進入慢性炎癥反應(yīng)階段[3]。由于缺乏特異性的抗原標(biāo)志物來鑒別定居的小膠質(zhì)細胞和外來侵入的單核巨噬細胞，所以無法區(qū)別脊髓損傷炎癥反應(yīng)過程中的主要細胞來源。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后早期，首先是損傷中心脊髓組織內(nèi)的小膠質(zhì)細胞快速激活；至術(shù)后第7天可以觀察到周圍灰質(zhì)和白質(zhì)中小膠質(zhì)細胞發(fā)生激活樣形態(tài)學(xué)變化，并向損傷中心遷移、聚集；在術(shù)后第7-14天，激活小膠質(zhì)細胞的表達在損傷組織中達到峰值；同時,IL-6表達水平亦在術(shù)后第7天時呈高表達狀態(tài)，隨后隨著時間的推移，IL-6水平逐步下降，其表達水平的變化與損傷區(qū)域小膠質(zhì)細胞的激活聚集的情況變化相一致。我們的結(jié)果與其它文獻中報道的小膠質(zhì)細胞在脊髓損傷中的激活過程相似[4]。

圖2 脊髓損傷后脊髓局部組織內(nèi)IL-6的表達情況(Sham為對照組，SCI為損傷組)

早期的研究認為小膠質(zhì)細胞在脊髓損傷中的作用是負面的，激活的小膠質(zhì)細胞除了吞噬細菌、組織碎片之外，自身還釋放大量的炎癥介質(zhì)，激活的小膠質(zhì)細胞除了消滅“有害物質(zhì)”之外，還對正常的神經(jīng)細胞產(chǎn)生殺傷作用，導(dǎo)致神經(jīng)軸突脫髓鞘，星形膠質(zhì)細胞活化，局部膠質(zhì)瘢痕的形成等，形成對神經(jīng)細胞有害的局部微環(huán)境[5]。近幾年的一些研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞合成一些神經(jīng)營養(yǎng)因子如NT-3、BDGF等，具有促進神經(jīng)細胞存活的作用；此外，小膠質(zhì)細胞還能合成具有促進神經(jīng)軸突再生延伸作用的神經(jīng)生長因子如NGF、IGF-1等[6,7]。所以，采用相關(guān)的治療手段，控制損傷局部的炎癥反應(yīng)在“適當(dāng)”程度內(nèi)，抑制小膠質(zhì)細胞的過度激活，減少相關(guān)促炎因子的合成，從而發(fā)揮小膠質(zhì)細胞的保護性作用。

最近的研究結(jié)果顯示，根據(jù)細胞表面特異性標(biāo)志物的不同，小膠質(zhì)細胞的激活過程中可以發(fā)生兩種不同的表型分化(M1和M2型)。M1型小膠質(zhì)細胞主要提高免疫水平，合成促炎因子(TNF-α、IL-1、IL-6)，M2型小膠質(zhì)細胞則具有抑制細胞免疫狀態(tài)，釋放抑炎因子(IL-4、IGF-1、IL-10)等[8]。這兩種表型分化在小膠質(zhì)細胞的激活過程中是可以進行相互轉(zhuǎn)化，有研究中發(fā)現(xiàn)，在損傷一周內(nèi)，損傷區(qū)域周圍可以觀察到M1和M2兩種表型分化；而在損傷后28天，損傷區(qū)域只能觀察到M1型小膠質(zhì)細胞激活，通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2表型定向分化和M1表型小膠質(zhì)細胞向M2表型的轉(zhuǎn)化，小鼠的神經(jīng)運動功能相應(yīng)地得到了更好的恢復(fù)[9]。

綜上我們認為，炎癥反應(yīng)與脊髓損傷的預(yù)后具有密切的關(guān)系，控制脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)，調(diào)控小膠質(zhì)細胞的表型分化是調(diào)節(jié)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)水平，促進運動功能恢復(fù)的重要研究方向和重要途徑之一。

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