甲狀腺破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞性未分化癌臨床病理及分子病理特點(diǎn)分析

黃思念,王麗梅,姚俊霞,劉繼燦,朱 婷

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院 病理科，上海201700)

甲狀腺未分化癌(ATC)是一種非常少見的高度侵襲性腫瘤，約占甲狀腺惡性腫瘤5%，中位生存期約5個(gè)月[1]。ATC目前被認(rèn)為起源于濾泡細(xì)胞，雖然非常少見，但生物學(xué)行為高度惡性，并且預(yù)后很差[2]。外科手術(shù)，放療和化療，多重治療模式據(jù)報(bào)道[2]對ATC有效，但這些治療模式只能改善腫瘤局部進(jìn)展速度，并不能提高腫瘤的治愈率和生存率。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，小分子抑制劑和單克隆抗體在現(xiàn)在的腫瘤治療中得到廣泛使用，但ATC的治療目前并沒有成熟的靶向藥物。研究甲狀腺未分化癌的臨床病理及分子病理特點(diǎn)，對于揭示甲狀腺未分化癌的發(fā)病機(jī)制以及研究靶向藥物，均有十分重要的意義。ATC少見的組織學(xué)亞型有[3]：(1)鱗狀細(xì)胞亞型；(2)腺鱗癌亞型；(3)淋巴上皮樣腫瘤亞型；(4) 柱狀細(xì)胞亞型；(5)破骨細(xì)胞亞型；(6) 癌肉瘤亞型；(7) 少細(xì)胞亞型；(8) 血管瘤樣亞型。目前有關(guān)甲狀腺破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞性未分化癌的相關(guān)研究較為少見，現(xiàn)報(bào)導(dǎo)破骨細(xì)胞亞型兩例，同時(shí)分析其臨床病理及分子病理特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1臨床資料

例1，患者男，51歲，因頸前區(qū)不適一月余入院，查B超示雙側(cè)甲狀腺腫塊實(shí)性占位。入院查體：左頸前區(qū)可捫及一4 cm×3 cm腫塊，右頸前區(qū)可及一2 cm×2 cm腫塊。行雙側(cè)甲狀腺及峽部切除術(shù)，術(shù)中見雙側(cè)甲狀腺腫大，約10 cm×10 cm×6 cm，多發(fā)結(jié)節(jié)，邊界不清，質(zhì)偏硬，表面欠光滑。術(shù)后隨訪半年，患者死于雙肺腫瘤轉(zhuǎn)移。

例2，患者女，79歲，發(fā)現(xiàn)頸前區(qū)腫塊一周入院，查B超示雙側(cè)甲狀腺混合回聲團(tuán)塊。入院查體：頸前區(qū)偏左側(cè)可捫及一腫塊，約有5 cm×5 cm。行雙側(cè)甲狀腺及峽部切除術(shù)，術(shù)中見左側(cè)甲狀腺、峽部、右側(cè)部分甲狀腺明顯腫塊形成，呈魚肉狀，表面不規(guī)則，浸潤性生長，腫塊大小約6.5 cm×5.5 cm。術(shù)后失訪。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察。

免疫組化染色使用LEICA全自動免疫組化染色儀(LEICA BOND- MAX)，采用Envision兩步法，一抗包括CD68，CgA，Desmin，TTF- 1，HMB45，CK7，Vimentin，Syn，CK19，TG，PCK，PAX- 8，LCA，EMA，SMA，CD34，購自DAKO公司和基因科技公司，DS9800(LEICA)為二抗。用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

甲狀腺基因突變檢測委托廈門飛朔生物技術(shù)有限公司完成?；蛲蛔儥z測具體步驟為：

(1)DNA樣品檢測：瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白質(zhì)污染，同時(shí)對DNA的濃度和純度進(jìn)行精確定量；

(2)建庫捕獲：采用飛朔生物自主專利技術(shù)RingCapTM文庫構(gòu)建技術(shù)，對樣本DNA進(jìn)行文庫制備，對目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增捕獲，并使產(chǎn)物形成粘性末端，形成環(huán)形產(chǎn)物，同時(shí)對環(huán)形產(chǎn)物進(jìn)行特異性擴(kuò)增放大；

(3)庫檢：使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量，隨后使用qPCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量；

(4)上機(jī)測序：根據(jù)庫檢合格文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進(jìn)行Ion torrent平臺PGM測序；

(5)數(shù)據(jù)分析：測序完成后，獲得原始測序序列，對測序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，評估之后對樣本進(jìn)行變異檢測。

2 結(jié)果

2.1眼觀例1巨檢：雙側(cè)甲狀腺切除組織，大小9 cm×7 cm×5 cm，切面見一結(jié)節(jié)，大小6 cm×5 cm×4 cm，部分區(qū)壞死，結(jié)節(jié)外部分區(qū)呈灰白色，質(zhì)嫩。例2巨檢：雙側(cè)甲狀腺切除組織，大小6.5 cm×5.5 cm×5 cm，切面見一結(jié)節(jié)，大小6.5 cm×5 cm×5 cm，表面尚光滑，切面灰白、灰紅，魚肉狀。

2.2鏡檢例1 診斷：(雙側(cè)甲狀腺)鏡下病變區(qū)見大量增生異型短梭形細(xì)胞及破骨樣巨細(xì)胞，可見核分裂像及大片壞死，浸潤甲狀腺組織，部分區(qū)可見增生異型上皮細(xì)胞，并見少量真乳頭結(jié)構(gòu)，考慮甲狀腺未分化癌(破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞型)伴小灶區(qū)乳頭狀癌形成。免疫組化：CD68(巨細(xì)胞+)，TTF- 1(乳頭+)，Vimentin(+)，CK19(少數(shù)+)，TG(乳頭+)，PCK(部分+)，Ki- 67(約10%+)，PAX- 8(-)，CgA(-)，Desmin(-)，HMB45(- )，CK7(-)，Syn(-)。

例2診斷：(雙側(cè)甲狀腺)未分化癌，破骨巨細(xì)胞型，腫瘤浸潤周圍甲狀腺組織，周圍脈管內(nèi)見癌栓，甲狀腺切緣未見腫瘤累及。免疫組化：PCK(灶性+)，CK7(灶性+)，CK19(灶性+)，EMA(+)，Vimentin(+)，CD68(巨細(xì)胞+)，Ki- 67(約5%+)，TG(-)，PAX- 8(-)，SMA(-)，Desmin(-)，LCA(-)，CD34(-)。

2.3基因突變分析結(jié)果例1出現(xiàn)KRAS、NRAS、PIK3CA基因突變；例2出現(xiàn)NRAS基因突變(見表1)。

表1 甲狀腺未分化癌兩例基因突變位點(diǎn)

3 討論

3.1ATC的診斷標(biāo)準(zhǔn)及其細(xì)胞起源甲狀腺未分化癌的WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)指出：(1)腫瘤以未分化成分為主；(2)必須有明確的上皮分化組織學(xué)證據(jù)，如果沒有，必須有PCK,TG或TTF- 1陽性[4]。Lee等[5]指出，診斷ATC，其未分化細(xì)胞成分必須大于10%。本研究中的兩例ATC，均以大量增生的破骨樣巨細(xì)胞為主，同時(shí)伴隨上皮標(biāo)記的部分表達(dá)。Parenti等[3]指出，大部分的ATC存在殘存的分化好的甲狀腺腫瘤病灶，包括乳頭狀癌和濾泡癌。例1出現(xiàn)少量乳頭狀癌的結(jié)構(gòu)，但甲狀腺未分化成分>10%,故仍然診斷為ATC。

ATC中經(jīng)常可以看到核分裂，包括非典型核分裂。出血和壞死，有時(shí)也可以經(jīng)?？吹郊?xì)胞排列成柵欄狀。雖然上述的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)代表了ATC普遍的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，隨著研究的深入，許多新的形態(tài)學(xué)亞型也被描述出來，其中破骨細(xì)胞亞型的定義為混雜的腫瘤細(xì)胞中包含反應(yīng)性的CD68陽性破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞[3]。我們研究中的兩例ATC，鏡下均見大量破骨樣巨細(xì)胞，CD68示巨細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，符合ATC破骨細(xì)胞亞型改變。

有關(guān)ATC的細(xì)胞起源，目前廣泛接受的觀點(diǎn)是，ATC來源于之前存在的低侵襲性分化好的甲狀腺腫瘤，比如PTC(乳頭狀癌)和FTC(濾泡癌)，通過發(fā)生去分化的方式，在ATC中發(fā)生EMT，表現(xiàn)為失去上皮和甲狀腺的分化標(biāo)記，隨著Vimentin表型的表達(dá)，同時(shí)伴隨TTF- 1和TG表型的喪失[6]。Fuziwara等[7]認(rèn)為，在ATC中，TGF信號通路誘導(dǎo)EMT的產(chǎn)生，開始表達(dá)間葉表型vimentin。在我們的病例中，同樣可以觀察到，兩例ATC均表達(dá)vimentin，同時(shí)在ATC區(qū)域出現(xiàn)TTF- 1和TG表型的喪失，同時(shí)其中1例殘存少許乳頭狀癌結(jié)構(gòu)，支持ATC來源于之前存在的低侵襲性分化好的甲狀腺腫瘤。

3.2ATC的臨床病理特征ATC多見于女性病人，中位年齡70歲，容易表現(xiàn)為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫[3]。本研究中，兩例患者術(shù)前B超檢查，均提示甲狀腺多發(fā)結(jié)節(jié)，類似于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫改變，大體改變具有一定的迷惑性。ATC盡管形態(tài)學(xué)上分化差，但大約45%-80% 表達(dá)PCK[3]。在我們的病例中，也出現(xiàn)上皮標(biāo)記的部分表達(dá)。Becker等[4]指出，PAX- 8似乎可以作為甲狀腺濾泡上皮腫瘤一個(gè)特異性的標(biāo)記，在ATC的診斷不明確時(shí)，PAX- 8可以作為ATC一個(gè)較好的診斷指標(biāo)，并指出PAX- 8陽性的病人更常見于年輕病人，并且預(yù)后更好。但在我們的病例中，PAX- 8均呈陰性反應(yīng)，或許與病例均為老年患者有關(guān)。但PAX- 8是否可以作為ATC的一個(gè)診斷指標(biāo)，還需大樣本量的病例研究。有研究者指出[8]，使用Ki- 67增殖指數(shù)可以對甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞腫瘤進(jìn)行預(yù)后分類，Ki- 67的指數(shù)≥10%，加上腫瘤壞死和核異型性的增加等形態(tài)學(xué)特征，可以提示甲狀腺腫瘤的高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性。在我們的病例中，其中1例Ki- 67的指數(shù)約為10%，伴隨大片壞死及大量的異型核，能夠提示該病例預(yù)后差。

3.3基因突變目前ATC最常見的基因突變有BRAF和 RAS基因突變，在大約在50%- 60%的ATC中可以觀察到，其次是 PIK3CA ，以及一些少見的HRAS,CDKN1B,CDKN2C,CTNNB1,HRAS 和 RET的突變[9]。在我們的病例中，均出現(xiàn)Ras基因突變，其中1例伴隨出現(xiàn)PIK3CA基因突變，2例均無BRAF基因突變。

Ras基因編碼p21，Ras基因的突變在甲狀腺癌的早期發(fā)生中起作用，與腫瘤組織的分化有關(guān)，但對腫瘤組織的惡性轉(zhuǎn)化不起決定性作用[10]。Ras基因突變熱點(diǎn)集中于H- Ras、K- Ras和N- Ras的突變，其中以N- Ras突變最為常見[11]。在我們的病例中，均出現(xiàn)Ras基因突變，并且也以N- Ras突變?yōu)橹鳎c文獻(xiàn)報(bào)道相符。

BRAF基因位于染色體7q34，目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為BRAFV600E的突變導(dǎo)致甲狀腺腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，良性結(jié)節(jié)中幾乎不發(fā)生BRAF V600E的突變，因此認(rèn)為BRAF V600E的突變對甲狀腺癌是特異性較高的診斷標(biāo)志之一[13]。PIK3CA基因是位于染色體3q26.3上的一段34kb的基因，主要功能是催化4,5- PIP2成為3,4,5- PIP3，而PIP3可作為第二信使結(jié)合并激活多種細(xì)胞內(nèi)靶蛋白[14]。有研究者在鼠模型中發(fā)現(xiàn)，PIK3CA的突變并不能獨(dú)立驅(qū)動甲狀腺腫瘤的產(chǎn)生，只有同時(shí)發(fā)生PIK3CA和BRAFV600E的突變，小鼠才會發(fā)展為ATC[15]。該研究者同時(shí)認(rèn)為，ATC中存在特定的突變特點(diǎn)，即Ras基因的突變與BRAF基因的突變互不相交[15]。在我們的病例中，均出現(xiàn)Ras基因的突變，均未出現(xiàn)BRAF基因的突變，或許與ATC中,這兩類基因突變互不相交的突變特點(diǎn)有關(guān)。但其中1例Ras基因的突變伴隨PIK3CA基因的突變，與文獻(xiàn)報(bào)道不盡相符，我們推測，PIK3CA基因的突變或許并不能獨(dú)立驅(qū)動甲狀腺腫瘤的產(chǎn)生，但未必一定伴隨BRAF基因的突變，或許存在其他基因伴隨突變的可能。

有研究者發(fā)現(xiàn)，BRAF基因突變的ATC主要表現(xiàn)為局灶性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而RAS基因突變的ATC主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移[16]。在我們的兩例ATC中，均未行淋巴結(jié)清掃，雖然無法獲知是否發(fā)生了淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，但其中1例出現(xiàn)雙肺轉(zhuǎn)移，或許也與Ras基因突變易遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的臨床特點(diǎn)有關(guān)。

3.4預(yù)后根據(jù)TNM分期，所有的ATC患者都是IV期[9]。腫瘤的大小，病人的性別，甲狀腺外的浸潤以及白細(xì)胞浸潤情況都被認(rèn)為是ATC的預(yù)后因素[2]。小尺寸的ATC，或?yàn)V泡型的ATC，起源于分化好的甲狀腺腫瘤，通常預(yù)后更好[3]。ATC治愈率低的原因在于，晚期腫瘤過大，難以完整切除，存在大約20%- 50%的肺轉(zhuǎn)移率[17]。預(yù)后較好的指標(biāo)有：診斷時(shí)無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，腫瘤大小<6- 7 cm，年齡< 65歲[4]。其中淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，是影響ATC預(yù)后的關(guān)鍵因素[5]。在我們的兩例ATC中，兩例均未行淋巴結(jié)清掃，無法獲得病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，但其中1例病人術(shù)后半年即發(fā)生雙肺轉(zhuǎn)移，并且腫瘤組織的大小均大于6 cm，其中1例出現(xiàn)脈管內(nèi)癌栓且年齡>65歲，均提示這兩例ATC預(yù)后差。

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