凝結(jié)芽孢桿菌益生機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展

郭慶豐，陳林，*，馬經(jīng)緯

（1.黃河科技學(xué)院，河南鄭州450063；2.鄭州市藥用資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450063）

益生菌是指一類服用足夠數(shù)量能夠?qū)λ拗鹘】涤幸娴幕钚晕⑸?，其主要作用在于其進(jìn)入腸道后能夠維持腸道菌群的平衡，促進(jìn)有益菌的繁殖和抑制致病菌生長，因此對人體健康有益[1-2]。凝結(jié)芽孢桿菌既能像乳酸菌和雙歧桿菌具有益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性強(qiáng)、耐高溫高壓和易貯藏等優(yōu)點(diǎn)，能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)腸道功能紊亂、維持腸道內(nèi)菌群平衡和提高機(jī)體免疫水平、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)代謝和利用，是近年來研究的熱門菌種。本文主要對凝結(jié)芽孢桿菌概況、生物學(xué)特性、益生作用機(jī)理、安全性、微生態(tài)制劑及臨床應(yīng)用研究等方面進(jìn)行綜述。

1 凝結(jié)芽孢桿菌概況

1915年，Hammer[3]首次從凝結(jié)的變質(zhì)牛奶中分離出凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans），1932 年，Sarles等[4]對凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行了詳細(xì)描述，同年，Horowitz-Wlassowa和Nowotelnow首次用芽孢乳酸菌（Lactobacillus sporogenes）來描述凝結(jié)芽孢桿菌，由于其含有乳酸菌和芽孢桿菌的雙重特性，其分類一直存在爭議，直到第八版的《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》（Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology）將接觸酶陽性的，嗜熱的乳桿菌歸于芽孢桿菌屬，將其重新分類，統(tǒng)一規(guī)范命名了凝結(jié)芽孢桿菌[5]。凝結(jié)芽孢桿菌在1989年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）評為“普遍認(rèn)為安全”的一類桿菌，此外該菌被評價(jià)為缺乏產(chǎn)毒潛能，獲得了歐洲歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）的安全資格認(rèn)定（Qualified Presumption of Safety，QPS）[6-7]。該菌在日本、美國、歐洲等地已經(jīng)被應(yīng)用于藥品、食品和飼料添加劑等行業(yè)[8-11]。我國農(nóng)業(yè)部亦于2004年在第372號公告中，批準(zhǔn)了天津市新星獸藥廠將凝結(jié)芽孢桿菌TQ33作為仔雞和生長育肥豬的食品添加劑的申請[12]。2005年，由青島東海藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的凝結(jié)芽孢桿菌活菌片，也獲得國家食品和藥品監(jiān)督管理局新藥證書[13]。

2 凝結(jié)芽孢桿菌生物學(xué)特性

凝結(jié)芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門，營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)、成對、少數(shù)呈短鏈狀，芽孢端生，無鞭毛，最適生長溫度為45℃～50℃，最適pH為6.6～7.0，其能分解小分子糖類生成L-1乳酸，為同型乳酸發(fā)酵菌，過氧化氫酶陽性[14-15]。凝結(jié)芽孢桿菌除具有和乳酸菌及雙歧桿菌同樣的保健功效外，還具有耐胃酸、耐熱、耐膽堿鹽、降解亞硝酸鹽、容易培養(yǎng)和保存等特點(diǎn)。趙虎山等[11]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌TQ33經(jīng)90℃，60 min濕熱和120℃，60 min干熱處理，其活菌數(shù)只下降1個(gè)數(shù)量級；將其置于pH大于2.42的酸性溶液中，存放1年后，其存活率仍高達(dá)105；凝結(jié)芽孢桿菌NJ102在pH 2.5的模擬胃液中處理12 h，存活率為71.9%。在膽鹽濃度0.3%和pH 8.0的模擬腸液中處理12 h，存活率為84.4%，該菌可有效降解亞硝酸鹽，48 h降解率達(dá)到96.8%[16]。

3 益生作用機(jī)理

凝結(jié)芽孢桿菌作為益生菌中的一種，目前還未見其益生作用機(jī)制的確切報(bào)道，不過學(xué)者普遍認(rèn)為其在腸道中所起的生理調(diào)節(jié)功效并非單一物質(zhì)的作用，而是其分泌多種代謝產(chǎn)物以及與腸道其它益生菌協(xié)同作用的結(jié)果。

3.1 調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡

凝結(jié)芽胞桿菌是一種兼性厭氧菌，能適應(yīng)腸道內(nèi)低氧環(huán)境，進(jìn)入腸道后，在腸道內(nèi)定植，通過消耗游離氧，抑制需氧型有害菌的生長，同時(shí)促進(jìn)厭氧益生菌如乳酸菌、雙歧桿菌等的增殖；產(chǎn)生乳酸降低腸道pH值，并分泌多種抗菌的細(xì)菌素類多肽物質(zhì)如凝固素等，能夠抑制腸道有害菌的生長，從而有效恢復(fù)并維持腸道微生態(tài)平衡，進(jìn)而提高生物體免疫力，減少腸道疾病的發(fā)生。除此之外，它能產(chǎn)生雙乙酰、有機(jī)酸等多種代謝產(chǎn)物，減少胺類等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，不僅能改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，同時(shí)也改善體外環(huán)境，從而減少疾病的發(fā)生與傳播[17-18]。

3.2 促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收

凝結(jié)芽孢桿菌可以通過3種方式促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。一是促進(jìn)產(chǎn)生多種消化酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶及乳酸脫氫酶等有助于提高胃腸道對食物消化，降解難以被宿主消化的復(fù)雜碳水化合物，如果膠、葡聚糖、乳糖、纖維素和木聚糖等[19-23]；二是在腸道內(nèi)生長、繁殖和定植后，其自身能直接產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)供機(jī)體吸收利用，如氨基酸、維生素、短鏈脂肪酸和促生長因子等，它們同其它益生菌協(xié)同作用促進(jìn)小腸蠕動，改善腸道功能，從而促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收；三是可以通過產(chǎn)生乳酸促進(jìn)動物機(jī)體對鐵、磷、鈣和維生素D等的吸收[12-13]。

3.3 提高免疫力，增強(qiáng)抗病力

益生菌能夠提高免疫系統(tǒng)的免疫能力，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的活性，增加胃腸道等器官對病原微生物的抵抗能力[24-26]。體外試驗(yàn)表明，凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵上清液及細(xì)胞壁成分可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、抑制活性氧和增強(qiáng)細(xì)胞吞噬作用來提高腸道免疫能力，另外凝結(jié)芽孢桿菌能促進(jìn)消化道粘膜發(fā)生免疫反應(yīng)[27-28]。Baron等[29]研究證明，凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30能夠提高T細(xì)胞中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，可用來防治腺病毒和甲型流感病毒等特定病毒感染。王文杰等[30]發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌TBC169能顯著提高免疫功能低下小鼠的免疫功能，減少正常小鼠腸道中胺和氨的含量，從而增強(qiáng)機(jī)體抵抗力和保護(hù)機(jī)體。

4 安全性

益生菌一直被認(rèn)為是安全的，但也有研究發(fā)現(xiàn)益生菌能造成宿主機(jī)體感染，產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生過度的免疫反應(yīng)以及引起耐藥基因的轉(zhuǎn)移等，給一些人群帶來安全隱患，并且臨床上也出現(xiàn)了服用益生菌制劑致病的案例[30]。不過歐洲食品安全局認(rèn)為凝結(jié)芽孢桿菌是對所有抗生素都是敏感的，不攜帶耐抗生素基因；毒理學(xué)安全性實(shí)驗(yàn)表明，凝結(jié)芽孢桿菌沒有無致誘變，致畸變以及遺傳毒性效應(yīng)。Endress等[31-32]報(bào)道，凝結(jié)芽孢桿菌對大鼠的急性和90 d的亞慢性口服毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其無明顯毒害劑量為1 000 mg/（g·d），活菌濃度為1.36×1011CFUs/g，相當(dāng)于平均重70 kg，其安全口服劑量為95.2×1011CFUs。為了進(jìn)一步研究凝結(jié)芽孢桿菌安全性，他們又對其進(jìn)行了長達(dá)一年的慢性口服毒性聯(lián)合繁殖毒性研究，其結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌沒有對大鼠親代及其子孫顯示任何毒性。且對于一個(gè)70 kg的人來說，長期每天攝入量為9.38×1010CFUs的凝結(jié)芽孢桿菌是安全的。

Majeed等[33-34]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌MTCC 5856不會像其他芽孢桿菌一樣產(chǎn)生腸毒素，也不含有腸毒素基因，沒有明顯的細(xì)胞毒性，且不會產(chǎn)生誘變效應(yīng)，能夠在常溫下存活3年。凝結(jié)芽孢桿菌在烘焙食品、飲料、植物油、濃縮糖漿甚至煮咖啡中都非常穩(wěn)定。

凝結(jié)芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中具有廣譜抗菌效果的多肽類細(xì)菌素物質(zhì)，通過MTT實(shí)驗(yàn)證明沒有明顯細(xì)胞毒性，且能夠被蛋白酶水解[35-36]。

5 凝結(jié)芽孢桿菌在微生態(tài)制劑方面的應(yīng)用

微生物菌劑是指利用益生菌的生長及其代謝產(chǎn)物制成的活菌制劑，具有調(diào)整維持動物腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)機(jī)體胃腸道吸收、提高免疫力的作用。凝結(jié)芽孢桿菌由于具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫高熱、易貯藏等特性，能順利通過胃酸和消化酶的雙重作用進(jìn)入腸道定植，并在腸道迅速復(fù)蘇成為活菌，發(fā)揮其對動物腸道的保健作用，凝結(jié)芽孢桿菌這些特性決定了其作為一種微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖及家禽養(yǎng)殖方面有很好的應(yīng)用前景。

5.1 凝結(jié)芽孢桿菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水產(chǎn)動物代謝物以及養(yǎng)殖水體的富營養(yǎng)化問題日趨嚴(yán)重，各種有害物質(zhì)或有機(jī)物在養(yǎng)殖水體中大量積累富集[37]。利用抗生素防治病害是最直接有效的方法，然而抗生素會產(chǎn)生耐藥性以及對養(yǎng)殖水體造成污染。高密度養(yǎng)殖模式導(dǎo)致抗生素濫用和殘留禁用抑菌試劑對水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重危害。益生菌能夠抑制有害菌并優(yōu)化水體菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到水體內(nèi)生態(tài)平衡，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[38]。

凝結(jié)芽孢桿菌能夠分解養(yǎng)殖水體中的大分子有機(jī)物，并大量消耗水體中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為無機(jī)鹽從而改良水質(zhì)，且可以為單細(xì)胞藻類提供營養(yǎng)[39]。藻類的光合作用為微生物和水產(chǎn)動物的呼吸提供氧氣，達(dá)到養(yǎng)殖水體的良性循環(huán)，使水體中的致病菌得到抑制[40]，既解決了水產(chǎn)動物酶制劑易失活和熱穩(wěn)定性差的缺陷，又有效抑制了抗藥性的產(chǎn)生。因此，凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖能夠減少甚至消滅水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害的發(fā)生，最終提高水產(chǎn)品品質(zhì)。

國外有研究表明，芽孢桿菌能夠增加腸粘膜的厚度、腸絨毛的高度和密度，進(jìn)而有效促進(jìn)腸道發(fā)育[41]。袁豐華等[42]將凝結(jié)芽孢桿菌添加在尖吻鱸的飼料中連續(xù)投喂50天后，尖吻鱸的增重率提高了9.45%?？锶旱萚43]在團(tuán)頭魴養(yǎng)殖飼料中單獨(dú)添加凝結(jié)芽孢桿菌，團(tuán)頭魴的特定生長率、蛋白質(zhì)效率、腸道凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量和蛋白酶活力顯著提高，飼料系數(shù)和腸道大腸埃希菌數(shù)量顯著降低。張維娜等[44]將不同含量的凝結(jié)芽孢桿菌添加到異育銀鯽幼魚飼料中發(fā)現(xiàn)添加0.3%凝結(jié)芽孢桿菌可較好地促進(jìn)異育銀鯽幼魚的生長，提高機(jī)體免疫力。在飼料中添加0.3%、0.5%凝結(jié)芽孢桿菌能夠顯著提高魚體的增質(zhì)量率、特定增長率、肝臟的總抗氧化能力及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性，并能夠顯著降低餌料系數(shù)；添加0.5%凝結(jié)芽孢桿菌能顯著提高堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性及總蛋白質(zhì)含量；添加0.3%凝結(jié)芽孢桿菌能顯著降低堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性；添加0.1%凝結(jié)芽孢桿菌能顯著降低堿性磷酸酶活性，顯著提高肝臟的過氧化氫酶活性。汪波等[45]將凝結(jié)芽孢桿菌添加至凡納濱對蝦幼蝦飼料中飼養(yǎng)20 d發(fā)現(xiàn)隨著凝結(jié)芽孢桿菌添加量的增加，試驗(yàn)組凡納濱對蝦的增質(zhì)量率和特定生長率增高，同時(shí)顯著降低餌料系數(shù)，提高養(yǎng)殖的存活率，超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶活性增加。說明添加凝結(jié)芽孢桿菌可在一定程度上提高凡納濱對蝦幼蝦的生長性能和改善其非特異性免疫力。

5.2 凝結(jié)芽孢桿菌制劑在家禽養(yǎng)殖方面的應(yīng)用

研究表明凝結(jié)芽孢桿菌制劑對家禽動物雞、豬等的生長性能、機(jī)體免疫功能也具有比較顯著的影響。趙娜等[46]對凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞的生長性能、免疫器官指數(shù)、血清生化指標(biāo)及腸道菌群的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可抑制肉雞腸道中大腸桿菌的生長，提高免疫器官指數(shù)，降低死淘率。黃世猛等[47]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌可改善蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)，在蛋白質(zhì)代謝、脂質(zhì)代謝、肝功能和鈣磷吸收上都具有一定程度的改善作用。高書鋒等[48]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.15%凝結(jié)芽孢桿菌制劑可提高斷奶仔豬生長性能、降低糞樣致病菌數(shù)量、提高糞樣有益菌數(shù)量和改善養(yǎng)殖環(huán)境。洪文等[49]研究也表明，適量凝結(jié)芽孢桿菌可以提高斷奶仔豬生長性能，減少腹瀉。

6 臨床研究

凝結(jié)芽孢桿菌由于具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)消化吸收和增強(qiáng)免疫力等生物學(xué)功能，且安全有效，越來越多的國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注凝結(jié)芽孢桿菌臨床應(yīng)用研究。凝結(jié)芽孢桿菌除了對慢性結(jié)腸炎、腹瀉和便秘、呼吸道感染、陰道炎等疾病均有顯著的治療效果，還具有調(diào)節(jié)肌肉損傷和提高免疫力的功效。

大量臨床研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌可以用來治療腸道易激綜合癥、腸道失調(diào)綜合癥等，能夠減小腹瀉、腹脹、腹痛、嘔吐、排便次數(shù)和增強(qiáng)腸道運(yùn)動性[50-53]。Dutta等[54]評估了凝結(jié)芽孢桿菌作為益生菌類微生物菌劑對小兒腹瀉的臨床療效，結(jié)果顯示凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)入腸道分泌大量乳酸，恢復(fù)腸動力，抑制腸道有害菌并排除腸毒素，恢復(fù)腸道菌群平衡。2009年，國外學(xué)者[29]研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌能夠增加感染甲型流感病毒患者的T細(xì)胞產(chǎn)生TNF-腫瘤壞死因子。侯占英、黎素清[55-56]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌活菌片能夠降低3歲以下小兒反復(fù)呼吸道感染發(fā)生率，減少抗生素的使用。

Ralf等[57]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌聯(lián)合蛋白能夠降低肌肉損傷，加快復(fù)原。Jepner等[58]報(bào)道了凝結(jié)芽孢桿菌能夠增強(qiáng)2-甲基-2-羥基丁酸鈣（β-hydroxy-βmethylbutyrate calcium，CaHMB）（一種被證實(shí)能夠增強(qiáng)高強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致的肌肉損傷）對軍事訓(xùn)練引起肌肉損傷的復(fù)原，并能引起細(xì)胞因子反應(yīng)。

Riazi等[59]將凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液濃縮10倍檢測對陰道炎致病菌藤黃微球菌的抑制作用，結(jié)果顯示凝結(jié)芽孢桿菌是一種安全有效的抑菌制劑；翟新茹等[60]將凝結(jié)芽孢桿菌活菌片聯(lián)合甲硝唑栓治療細(xì)菌性陰道病療效顯著，能降低復(fù)發(fā)率。以上研究表明凝結(jié)芽孢桿菌在細(xì)菌性陰道炎的治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

此外，凝結(jié)芽孢桿菌能夠預(yù)防新生兒黃疸[61]，對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[28]、口瘡性口炎、齲齒[62]、嬰兒濕疹[63]等疾病具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

7 小結(jié)與展望

微生物發(fā)酵產(chǎn)物作為抑菌制劑具有天然高效的優(yōu)點(diǎn)，是化學(xué)藥物和抗生素的理想替代品。目前，對其應(yīng)用的相關(guān)研究較多，作用機(jī)理研究較少，其安全性評價(jià)也不夠全面。雖然部分微生物來源的抑菌制劑已經(jīng)投入市場，但是天然抑菌制劑較高的價(jià)格以及其安全性評價(jià)不足阻礙了其更進(jìn)一步推廣和應(yīng)用，僅有細(xì)菌素Nisin（Nisin是一種細(xì)菌素）等少數(shù)物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用。研究人員進(jìn)一步對產(chǎn)生相關(guān)抑菌物質(zhì)的菌株進(jìn)行遺傳改良，進(jìn)而提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，對高效安全并且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的天然抑菌制劑的開發(fā)具有重要意義。

凝結(jié)芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物研究較少，僅限于具有抑菌活性的多肽類和抗氧化活性的多糖類大分子的研究，其代謝產(chǎn)物除了有機(jī)酸、胺外，尚未見其它小分子報(bào)道。凝結(jié)芽孢桿菌可以提高機(jī)體免疫能力，但其起免疫作用的物質(zhì)基礎(chǔ)還不明確，因此對凝結(jié)芽孢桿菌免疫作用的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。

總之，凝結(jié)芽孢桿菌作為抑菌制劑的研究尚屬起步階段，但隨著學(xué)者們對其研究的進(jìn)一步深入，包括抑菌物質(zhì)基礎(chǔ)研究、抑菌機(jī)制探索以及提取工藝的優(yōu)化等，凝結(jié)芽孢桿菌必將在食品安全方面發(fā)揮重要作用。同時(shí)作為綠色高效抑菌制劑的應(yīng)用范圍將更加廣泛。