慢性髓細(xì)胞性白血病耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

程艷紅 徐修才

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院（合肥 230001）

慢性髓細(xì)胞性白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種骨髓增生性疾病，t（9；22）（q34；q11）易位是該病的特征性改變，并在分子水平上導(dǎo)致BCR?ABL融合基因的形成。研究表明，由Ph染色體產(chǎn)生的BCR?ABL融合蛋白是CML中的致病性癌蛋白，具有來自ABL酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的組成型激酶活性。伊馬替尼（imatinib mesylate，IM）是CML患者的一線藥物。研究表明相對(duì)于干擾素和STI571（IRIS），IM具有長(zhǎng)期有效性和安全性。初診患者接受IM治療的完全細(xì)胞遺傳學(xué)應(yīng)答為83%，這些患者8年的總生存期為85%［1］。盡管IM具有令人滿意的療效，但約有20%的患者對(duì)IM無應(yīng)答，稱之為原發(fā)性耐藥。一些患者在獲得應(yīng)答后失去對(duì)IM的反應(yīng)，稱為獲得性耐藥。此外，一部分患者不耐受IM的副作用，如血細(xì)胞減少、關(guān)節(jié)痛、肌痛。隨著第二代和第三代酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）的出現(xiàn)，如尼羅替尼、達(dá)沙替尼和潘他濱，這些藥物具有更多的靶點(diǎn)和更好的療效。然而，仍然有些CML患者對(duì)所有的TKIs無應(yīng)答。此外，完全分子學(xué)緩解的患者中斷治療以后，仍有60%的患者會(huì)發(fā)生分子水平的復(fù)發(fā)［2］。殘留的TKI耐藥的CML干細(xì)胞被認(rèn)為是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的原因。因此，有必要進(jìn)一步研究分子耐藥機(jī)制，尋找克服耐藥的新靶點(diǎn)。本文回顧了CML的不同分子耐藥機(jī)制，包括替代激酶的激活，BCR?ABL基因突變、擴(kuò)增或過表達(dá)，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增加以及其他機(jī)制，同時(shí)對(duì)這些耐藥分子機(jī)制的治療策略也進(jìn)行了回顧。

1 耐藥機(jī)制

1.1 依賴BCR?ABL激酶的TKIs耐藥機(jī)制

1.1.1 BCR?ABL激酶位點(diǎn)突變 目前認(rèn)為，BCR?ABL激酶點(diǎn)突變是TKIs獲得性耐藥最常見的原因。盡管TKIs在抑制和殺死大多數(shù)野生型CML細(xì)胞方面非常有效，但具有點(diǎn)突變的耐藥細(xì)胞存活并發(fā)展為優(yōu)勢(shì)克隆，從而導(dǎo)致耐藥性的形成。根據(jù)突變位置將點(diǎn)突變分為：IM結(jié)合位點(diǎn)、P?loop區(qū)域（ATP binding loop）、活化loop區(qū)域（activation loop）和催化區(qū)域。目前，已鑒定了100多種類型的BCR?ABL突變。第一個(gè)確定的點(diǎn)突變是T315I，其特征在于BCR?ABL蛋白的第315位的酪氨酸（Tyr）突變?yōu)楫惲涟彼帷?/p>

Tyr315與IM形成氫鍵，異亮氨酸替代酪氨酸干擾該鍵，異亮氨酸側(cè)鏈擾亂IM與BCR?ABL的結(jié)合［3］。ABL激酶的第24～255殘基被稱為P環(huán)，Y253H，G250E和E255K是P環(huán)中常見的突變［4］?；罨h(huán)（activation loop，A環(huán)）被定義為從381到402的殘基，具有兩個(gè)不同的構(gòu)象：活性和非活性構(gòu)象。IM的左邊部分與P環(huán)結(jié)合，其他部分伸展到激活環(huán)和在N末端的α和C螺旋之間的內(nèi)部部分，其使激酶穩(wěn)定在無活性構(gòu)象中。當(dāng)某些突變?nèi)鏗396P發(fā)生在A環(huán)中時(shí)，ABL激酶保持活性構(gòu)象，這使得IM難以結(jié)合ABL。催化結(jié)構(gòu)域從殘基350到363，并且該區(qū)域的突變也將影響對(duì)IM的敏感性。T315I是最常見的突變，并且對(duì)幾種TKIs，如IM、阿片替尼和尼羅替尼，往往伴有不良預(yù)后。研究表明慢性期突變的風(fēng)險(xiǎn)低于進(jìn)展期［5］，突變的潛在機(jī)制尚未得到充分證明。然而，可以斷定的是由BCR?ABL啟動(dòng)的途徑產(chǎn)生的活性氧（ROS）和容易出錯(cuò)的DNA修復(fù)機(jī)制有助于突變的風(fēng)險(xiǎn)［6］。

一般認(rèn)為，當(dāng)CML患者對(duì)TKI反應(yīng)較差時(shí)（診斷時(shí)除外），應(yīng)該評(píng)估患者的突變狀態(tài)。某些類型的突變對(duì)某些TKIs具有天然耐藥性。因此，確定突變的類型以選擇適當(dāng)?shù)腡KI是最有價(jià)值的［7］。然而，存在一些相反的意見，LQBAL等［8］認(rèn)為在診斷時(shí)未給予IM治療之前，他們就檢測(cè)到CD34+細(xì)胞的BCR?ABL激酶結(jié)構(gòu)域的突變，發(fā)現(xiàn)有32例患者發(fā)生突變。所有這些患者在隨訪期間對(duì)IM耐藥，而在這些患者中，治療后檢測(cè)到的突變類型與治療開始時(shí)相同。因此，研究者建議在TKI治療前檢測(cè)CD34+細(xì)胞的突變類型，以選擇合適類型的TKI進(jìn)行治療。

1.1.2 BCR?ABL激酶未突變的耐藥機(jī)制 此外，BCR?ABL基因的擴(kuò)增已經(jīng)在一些耐藥性的CML患者中通過熒光原位雜交鑒定。具體的基因擴(kuò)增機(jī)制尚未完全了解。斷裂-融合-橋接周期的重復(fù)循環(huán)，其中染色體斷裂在脆弱部位開始，可能部分地解釋了這種現(xiàn)象［9］。BCR?ABL基因的過表達(dá)也與CML患者的耐藥性有關(guān)。具有更強(qiáng)抑制BCR?ABL能力的下一代TKI可能有效抵抗這些耐藥機(jī)制。

1.2 不依賴于BCR?ABL激酶的耐藥機(jī)制 近年來，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在CML耐藥中的作用已被人們所認(rèn)知。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，可以根據(jù)運(yùn)輸方向分為流入和流出型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ATP結(jié)合盒B亞家族成員1（ABCB1）也稱為P-糖蛋白或MDR1，ATP結(jié)合盒G亞家族成員2（ABCG2）也稱為乳腺癌耐藥蛋白（BCRP），這兩種蛋白是外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OCT1或SLC22A1）和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1A2（SCL01A2或OATP1A2）是流入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)CML細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于TKIs時(shí)，誘導(dǎo)了許多耐藥性克隆。這些克隆經(jīng)常以高水平表達(dá)許多類型的外排藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，盡管它們沒有BCR?ABL突變或BCR?ABL基因的擴(kuò)增，這代表了另一種耐藥機(jī)制。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使細(xì)胞內(nèi)的藥物流出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度降低到有效水平以下，從而產(chǎn)生了耐藥性［10］。患者的臨床分析表明，表達(dá)高水平的ABCG2或ABCB1的患者對(duì)TKIs的反應(yīng)較差，長(zhǎng)期生存期較短，而對(duì)TKIs反應(yīng)較好的患者具有較高水平的SLC22A1流入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［11］。

1.3 激活替代激酶和信號(hào)通路的耐藥機(jī)制 在一些IM耐藥細(xì)胞中，沒有觀察到BCR?ABL的突變、擴(kuò)增或過表達(dá)以及外排藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，雖然這些細(xì)胞內(nèi)的IM能夠顯著抑制BCR?ABL的活性，但是這些細(xì)胞卻能存活并且觀察到過量的SRC激酶活化。因此，獨(dú)立于BCR?ABL的替代SRC信號(hào)傳導(dǎo)途徑被認(rèn)為是BCR?ABL抑制后的補(bǔ)償機(jī)制?，F(xiàn)在，許多數(shù)據(jù)可用于確定作為SRC激酶家族成員的LYN和HCK在TKI耐藥性中的作用［11］。此外，通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的定量表明，在尼羅替尼耐藥的CML細(xì)胞系中，脾酪氨酸激酶（SYK）和AXL的磷酸化升高。結(jié)果表明SYK和AXL與LYN和AXL相互作用，并且在耐藥CML患者中也過表達(dá)，說明AXL、SYK和LYN之間的相互作用可能會(huì)繞過CML細(xì)胞中BCR?ABL的參與［12］。最近通過對(duì)CML患者的耐藥細(xì)胞株的基因芯片研究證明，F(xiàn)YN，另一個(gè)SRC家族激酶，介導(dǎo)對(duì)TKIs的抵抗［13］。由于SRC激酶在CML的發(fā)展和耐藥性中的重要作用，已經(jīng)探索了幾種雙重BCR?ABL/SRC特異性抑制劑，即達(dá)沙替尼和博舒替尼，與IM相比，其對(duì)CML患者具有更好的療效。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5（STAT5）是JAK2的下游轉(zhuǎn)錄因子，在CML的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用［14］。有證據(jù)表明在BCR?ABL+細(xì)胞中，STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以獨(dú)立于JAK2而通過BCR?ABL介導(dǎo)，并且有促進(jìn)白血病細(xì)胞對(duì)抗TKIs治療的作用［15］。研究表明，STAT5促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，以增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生［15］。此外，STAT5結(jié)合ABCB1和端粒酶啟動(dòng)子來上調(diào)兩個(gè)基因的表達(dá)水平，并介導(dǎo)K562/ADM和K562?hTERT細(xì)胞系的耐藥性［16］。最后，STAT5已被證明可以抑制細(xì)胞凋亡并介導(dǎo)CML干細(xì)胞的增殖，保護(hù)干細(xì)胞免受外源性氧化應(yīng)激［17］。綜合起來，這些結(jié)果表明STAT5在CML的發(fā)展和耐藥中起核心作用。

1.4 細(xì)胞環(huán)境介導(dǎo)的TKI耐藥機(jī)制 BCR?ABL激酶活性導(dǎo)致ROS的積累，其水平在CML細(xì)胞系、干細(xì)胞和原始細(xì)胞中比在正常細(xì)胞中高2～6倍［7］。增加的ROS損傷DNA堿基和脫氧核糖核酸，導(dǎo)致堿性氧化損傷和DNA雙鏈斷裂（DSB）。在CML細(xì)胞中，氧化損傷的堿基遭到錯(cuò)配修復(fù)，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和隨后的遺傳事件，如突變和染色體易位、缺失，從而導(dǎo)致對(duì)TKI的抗性［18］。由于ROS介導(dǎo)的DNA損傷，存在多個(gè)基因和染色體易位或廣泛缺失的突變，導(dǎo)致腫瘤抑制因子失活和激活其他癌基因的概率增加，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的進(jìn)展，最后發(fā)展成為CML晚期階段獨(dú)立于BCR?ABL的耐藥機(jī)制。

在IM臨床中止試驗(yàn)中，超過一半的完全分子緩解的患者的復(fù)發(fā)被認(rèn)為與白血病干細(xì)胞（leukemia stem cells，LSCs）有關(guān)［19］。將完全分子緩解超過3年的CML患者的基質(zhì)細(xì)胞，在體內(nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)后，BCR?ABL轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)表明LSCs的持久性［2］。多種機(jī)制涉及LSCs對(duì)TKIs的抵抗，包括流入藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的下調(diào)，外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào)或者增加這些細(xì)胞內(nèi)的BCR?ABL轉(zhuǎn)錄本水平［20］。最近，人們已經(jīng)廣泛認(rèn)識(shí)到，CML干細(xì)胞能夠在不存在BCR?ABL的情況下存活。LSCs由骨髓微環(huán)境內(nèi)的許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子保護(hù)，并且可以在TKI存在下存活?；蚪M不穩(wěn)定性被認(rèn)為是CML慢性期的標(biāo)志。在新診斷的患者和治療中的患者的祖細(xì)胞和LSCs中測(cè)量ROS誘導(dǎo)的DNA損傷，發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的DNA損傷發(fā)生在LSCs而不是在祖細(xì)胞中，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并導(dǎo)致BCR?ABL激酶結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變和其他類型的突變，如插入和缺失［21］。

自噬在IM存在下保護(hù)LSC。據(jù)報(bào)道，與正常對(duì)照組相比，CML中CD34+細(xì)胞中的重要的自噬基因如ATG4B、ATG5和BECLIN?1高表達(dá)。對(duì)IM反應(yīng)良好的患者的ATG4B水平高于對(duì)IM反應(yīng)不良的患者。ATG4B水平較高，表明自噬參與了LSC對(duì)TKIs的抗性［22］。已經(jīng)證實(shí)一些信號(hào)通路在CML干細(xì)胞中起重要作用，包括PML、β?連環(huán)蛋白、Alox 5、Smoothened 和 SIRT1［22］，其提供了根除 CML干細(xì)胞的治療靶點(diǎn)。

1.5 其他耐藥機(jī)制

1.5.1 基因多態(tài)性 基因多態(tài)性已被證明與CML的耐藥性相關(guān)。MA等［23］報(bào)道在多發(fā)性TKI耐藥的CML患者中檢測(cè)到BCR?ABL的剪接突變。由移碼突變引起的BCR?ABL C末端的缺失可能會(huì)影響耐藥性。其他基因的基因多態(tài)性也參與耐藥性。通過對(duì)CML慢性期患者磷酸化和去磷酸化6相關(guān)個(gè)基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)顯示SOCS1的C等位基因和PTPN22的T等位基因是不良預(yù)后因素［24］。

1.5.2 自噬 自噬是一種循環(huán)過程，其螯合并降解溶酶體內(nèi)損傷的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞內(nèi)成分，并保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程。它對(duì)腫瘤有雙重作用，在白血病發(fā)生的早期階段，它作為腫瘤抑制因子來維持基因的穩(wěn)定性。然而，在腫瘤形成后，它起到抗應(yīng)激機(jī)制的作用，促進(jìn)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別是在缺氧或化療的條件下。當(dāng)用TKI治療時(shí)，大多數(shù)CML細(xì)胞響應(yīng)于TKI而發(fā)生細(xì)胞凋亡，其他細(xì)胞抵抗自噬，這使得它們能夠在TKI中存活，特別是CML干細(xì)胞。靶向自噬途徑有助于消除TKI難治性的CML干細(xì)胞，但對(duì)于BCR?ABL突變的體細(xì)胞沒有影響，因?yàn)樽允梢蕾囉赥KIs對(duì)BCR?ABL的有效抑制［25］。

1.5.3 MicroRNAs MicroRNAs（miRs）是具有調(diào)節(jié)靶基因能力的非編碼RNA。最近的研究表明，miRs參與CML細(xì)胞對(duì)TKIs的抵抗。miR451在CML診斷和復(fù)發(fā)時(shí)下調(diào)，它與BCR?ABL活性呈負(fù)相關(guān)，與CML患者對(duì)IM的反應(yīng)有關(guān)［26］。在IM誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株K562/R細(xì)胞中，miR217靶向調(diào)節(jié)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平隨著miR217水平的降低而增加［27］。miR還靶向調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，miR 212靶向調(diào)節(jié)ABCG2的3′?UTR，其在IM誘導(dǎo)的K562/R細(xì)胞系中高表達(dá)［28］。一些miRs靶向調(diào)控抗凋亡基因或自噬基因，甚至直接靶向調(diào)控BCR?ABL基因，通過降低靶基因水平來增加對(duì)TKIs的敏感性。

2 針對(duì)耐藥的治療對(duì)策

2.1 針對(duì)BCR?ABL的藥物 通過對(duì)CML細(xì)胞分子耐藥機(jī)制的研究為開發(fā)抗耐藥的新藥物提供了靶點(diǎn)。常規(guī)的BCR?ABL抑制劑，如IM、達(dá)沙替尼和尼羅替尼，臨床上新的可用的TKIs，如博舒替尼和帕納替尼，是相同類型的抑制劑。博舒替尼是第二代TKI，其靶向酪氨酸激酶和SRC，對(duì)其他TKIs反應(yīng)不良的CML患者發(fā)揮強(qiáng)大的作用。它克服了對(duì)大部分BCR?ABL突變體的抗性，T315I突變除外。帕納替尼是第三代TKI，對(duì)T315I突變效果良好，并且對(duì)各種其他突變體也具有積極作用。美國(guó)食品和藥物管理局已批準(zhǔn)此藥治療耐藥或不耐受的Ph陽性白血?。?9］。

2.2 針對(duì)替代激酶的靶向藥物 與慢性粒細(xì)胞白血病耐藥相關(guān)的替代激酶可作為治療的靶點(diǎn)?？紤]到SRC激酶家族在CML耐藥中的重要作用，已經(jīng)研發(fā)了小分子抑制劑如達(dá)沙替尼以靶向SRC激酶，并且已經(jīng)證明其在臨床實(shí)踐中的治療效果優(yōu)于IM。還研發(fā)了其他激酶抑制劑，如BI2536靶向PLK1，并已被證實(shí)可以抑制IM敏感性和CML耐藥細(xì)胞株的增殖，包括攜帶T315I突變的白血病細(xì)胞。還發(fā)現(xiàn)BI2536可加強(qiáng)IM或尼羅替尼的腫瘤細(xì)胞殺傷作用［30］。Aurora激酶抑制劑在近期CML研究中一直是高度活躍的課題。已經(jīng)在用于癌癥治療的臨床試驗(yàn)中開發(fā)并測(cè)試了許多Aurora激酶抑制劑。大量證據(jù)表明，各種pan?Aurora激酶抑制劑或Aurora A激酶選擇性抑制劑對(duì)IM敏感和IM耐藥的CML細(xì)胞均有效［31］。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，與組蛋白去乙?；敢种苿℉DACI）或長(zhǎng)春新堿的組合能夠增強(qiáng)Aurora激酶抑制劑對(duì)抗CML細(xì)胞的效果［32］。

2.3 針對(duì)信號(hào)通路的靶向藥物 涉及耐藥性的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵分子是克服耐藥性的有效靶點(diǎn)。索拉非尼是一種可以減少STAT5磷酸化的多激酶抑制劑。它能夠誘導(dǎo)IM耐藥細(xì)胞和BCR?ABL陽性細(xì)胞的凋亡，其中包括BCR?ABL高表達(dá)和不依賴BCR?ABL的LYN的異常激活，以及各種類型BCR?ABL突變，如T315I和來自難治性CML患者的CD34+細(xì)胞［33］。然而，索拉非尼不是STAT5的特異性抑制劑，其對(duì)CML的影響需要更多的研究。STAT5的選擇性抑制劑匹莫齊特對(duì)T315I突變和CML原代CD34+細(xì)胞產(chǎn)生凋亡作用。當(dāng)與IM或尼羅替尼組合時(shí)，它對(duì)CML細(xì)胞具有協(xié)同作用［34］。有研究表明，匹莫齊特聯(lián)合TKI的短暫治療對(duì)CML細(xì)胞的效果比JAK2抑制劑與TKI聯(lián)合使用的效果強(qiáng)［35］。

2.4 針對(duì)其他耐藥機(jī)制的靶向藥物 由BCR?ABL引起的ROS的升高和異常的DNA修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致基因突變和其他遺傳事件，從而導(dǎo)致CML耐藥性的產(chǎn)生及疾病的進(jìn)展。參與CML DNA異常修復(fù)的激酶是治療的靶點(diǎn)，通過對(duì)RAD51的抑制劑研究，表明RAD51是一種與CML耐藥性相關(guān)的重組激酶。IBR2干擾RAD51的多聚化，加速其蛋白酶體介導(dǎo)的降解并減少鐵輻射誘導(dǎo)的RAD51病灶形成。IBR2延長(zhǎng)了攜帶T315I細(xì)胞的小鼠的存活，并對(duì)原代CML CD34+干/祖細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用［36］。除藥理學(xué)藥劑外，已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中開發(fā)和測(cè)試了免疫療法，例如BCR?ABL或CML相關(guān)的抗原肽疫苗以及用活化的T細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的治療［37］。

3 結(jié)論

總之，多個(gè)機(jī)制參與CML的TKI耐藥性，包括BCR?ABL依賴機(jī)制，如BCR?ABL點(diǎn)突變，BCR?ABL基因擴(kuò)增和BCR?ABL轉(zhuǎn)錄本的過表達(dá)，以及BCR?ABL非依賴性機(jī)制，如替代激酶或信號(hào)通路的激活，骨髓微環(huán)境介導(dǎo)的耐藥性，異常的DNA監(jiān)測(cè)和修復(fù)，以及CML干細(xì)胞參與的耐藥性。目前，已經(jīng)探索了各種新穎的治療策略來針對(duì)這些耐藥機(jī)制，并且有希望克服耐藥性甚至根除CML干細(xì)胞來治愈疾病。

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