微小RNA經(jīng)Wnt通路調(diào)控成骨分化及其力學(xué)響應(yīng)的研究進(jìn)展

鄢志雄 綜述，汪 洋，郭 勇 審校

(桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西桂林 541004)

微小RNA(miRNA)是一類長度約22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過識別靶基因mRNA和靶基因mRNA的非編碼區(qū)堿基配對，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)[1]。miRNA在干細(xì)胞分化、增殖和新陳代謝中，起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[2]。Wnt信號通路是一個蛋白質(zhì)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，為生物生長發(fā)育所必需[3-4]。Wnt信號傳導(dǎo)路徑較多，據(jù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同，將Wnt信號通路分為經(jīng)由β-catenin的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路、調(diào)控細(xì)胞平面極性的Wnt/PCP(planner cell polarity pathway)信號通路和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣信號的Wnt/Ca2+信號通路[3]。后兩種被稱為非經(jīng)典Wnt信號通路。近年來，研究證明Wnt信號通路在干細(xì)胞的成骨分化和骨量維持上起著重要作用[4]。

力學(xué)載荷是控制骨重建的一個重要因素，適量的力學(xué)載荷能保持骨形態(tài)和功能的穩(wěn)定[5]。有報道顯示機(jī)械刺激能通過Wnt信號通路途徑影響干細(xì)胞的成骨分化[6-7]。近年來大量研究都集中在機(jī)械應(yīng)力刺激下干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制方向[8-10]。然而，力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的確切機(jī)制尚未研究清楚。Wnt信號通路可能在機(jī)械刺激下的干細(xì)胞成骨分化信號傳導(dǎo)過程中有重要地位，而與Wnt信號通路相關(guān)的miRNA也具有巨大的研究價值。本文就miRNA通過Wnt信號通路調(diào)控成骨分化的分子機(jī)制及力學(xué)載荷對此過程的影響方面的研究現(xiàn)狀及新進(jìn)展做一綜述。

1 miRNA在干細(xì)胞成骨分化中的調(diào)控作用

干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，其成骨分化是眾多基因程序性表達(dá)及精細(xì)調(diào)控的結(jié)果。miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，它通過調(diào)節(jié)靶基因mRNA的表達(dá)，來調(diào)控分化過程中多種相關(guān)因子和受體，從而完成對干細(xì)胞成骨分化的精確調(diào)控。近年來大量研究表明，miRNAs對成骨分化上游信號(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白，即bone morphogenetic protein，BMP)、成骨分化重要信號通路(如Wnt信號通路)及成骨分化下游標(biāo)志性基因(如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2，Runx2)等都有調(diào)控作用[11-13]。

1.1miRNAs與成骨分化上游信號 轉(zhuǎn)錄因子Dlx在干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮重要作用。QADIR等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，BMP-2介導(dǎo)的成骨分化過程中，人和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)中miR-124的表達(dá)與對照組相比約降低50%，而Dlx5、Dlx3和Dlx2的RNA和蛋白水平均數(shù)倍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，通過抑制miR-124的表達(dá)，結(jié)果表明Dlx基因的mRNA和蛋白的表達(dá)量均增加；且熒光素酶等相關(guān)報告基因分析表明，miR-124直接靶向Dlx3、Dlx5和Dlx2的3′-UTR。因此，miR-124通過作用于轉(zhuǎn)錄因子Dlx的3′-UTR，導(dǎo)致其mRNA的降解或翻譯阻遏，抑制骨的形成。

1.2miRNA與成骨分化下游標(biāo)志性基因 LI等[15]在研究小鼠BMSCs成骨分化時發(fā)現(xiàn)，在BMP-2誘導(dǎo)的成骨分化過程中，miR-2861通過抑制組蛋白脫乙?；?(histone deacetylase5，HDAC5)的表達(dá)，抑制Runx2降解，從而促進(jìn)骨形成。而在進(jìn)一步實驗中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)premiR-2861純合子發(fā)生突變，miR-2861表達(dá)量明顯下調(diào)，且HDAC5表達(dá)異常升高；而小鼠BMSCs實驗中，HDAC5表達(dá)增高的同時，Runx2表達(dá)降低，成骨分化作用受到抑制。因此，該研究結(jié)果提示miR-2861的異常表達(dá)作用于Runx2抑制成骨分化，并且與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生關(guān)系密切。XU等[16]研究了人BMSCs成骨分化過程中的某些miRNAs的功能，通過驗證發(fā)現(xiàn)其中miR-885-5p通過抑制Runx2及相關(guān)成骨基因的表達(dá)來調(diào)控成骨分化。

1.3miRNA經(jīng)Wnt信號通路在成骨分化中的調(diào)控作用 Wnt信號通路分為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路。經(jīng)典信號通路是由胞外的Wnt蛋白與膜上的相應(yīng)受體蛋白，F(xiàn)rizzled家族蛋白(frizzled proteins，F(xiàn)z)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor related protein，LRP)復(fù)合物結(jié)合，激活胞內(nèi)的散亂蛋白(dishevelled，Dsh或Dvl)，誘導(dǎo)胞內(nèi)的四聚體[APC蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、Axin支架蛋白、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、β-catenin]分解，使胞內(nèi)β-catenin的降解途徑無法進(jìn)行，β-catenin濃度升高，進(jìn)入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子(TCF/LEF)結(jié)合，最終誘導(dǎo)成骨相關(guān)靶基因的表達(dá)，調(diào)控成骨分化[17]。非經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)通路中，Wnt蛋白(主要包括Wnt5a、Wnt7a、Wnt11等)與Fz和LRP5/6結(jié)合引起相應(yīng)非經(jīng)典Wnt信號的激活[18]。miRNA對Wnt信號通路的調(diào)控分為3個部分：(1)miRNA可作用于細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)各種Wnt信號通路拮抗物[如Dickkopf相關(guān)蛋白(DKKs)、frizzled相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)等]的mRNA；(2)miRNA通過影響膜蛋白與受體結(jié)合及作用于四聚體(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)的各成分，影響胞內(nèi)的四聚體的合成，調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達(dá)。(3)miRNA還可通過非經(jīng)典Wnt信號通路中的相關(guān)因子來調(diào)控成骨分化過程。

1.3.1miRNA與細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的各種Wnt信號通路拮抗物 HASSAN等[19]研究人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)的成骨分化過程時發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的hADSCs在成骨分化過程中內(nèi)源性miR-218表達(dá)上調(diào)；增加外源性的miR-218促進(jìn)其成骨分化，而下調(diào)miR-218的表達(dá)可抑制其成骨分化。經(jīng)過對miR-218作用靶點的探究發(fā)現(xiàn)，miR-218直接作用靶點為SFRP2和DKK2(Wnt信號通路上游的抑制因子)，miR-218可解除SFRP2或DKK2對Wnt信號通路的抑制作用，從而激活Wnt/β-catenin信號通路；另外，模擬Wnt信號通路的激活或阻斷Wnt信號通路，hADSCs內(nèi)相應(yīng)的miR-218的表達(dá)水平隨之增加或減少。因此，該課題組推測miR-218與經(jīng)典Wnt信號通路對干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控是一種反饋調(diào)節(jié)過程。KAPINAS等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-29a/c對Wnt/β-catenin信號通路的抑制因子DKK1(Wnt信號通路的上游抑制因子)產(chǎn)生直接抑制效應(yīng)，使Wnt/β-catenin信號通路激活；另一方面，miR-29a/c又以骨黏蛋白為直接抑制對象，在成骨分化晚期抑制骨黏蛋白的表達(dá)水平，抑制成骨分化。

1.3.2miRNA與膜蛋白及胞內(nèi)的四聚體 LI等[21]研究結(jié)果表明，miR-23a在成骨分化的過程中明顯下調(diào)。過表達(dá)或下調(diào)miR-23a，體外hBMSCs的成骨分化受到相應(yīng)抑制或促進(jìn)。進(jìn)一步實驗證明，LRP5(Wnt蛋白的細(xì)胞膜受體蛋白)是miR-23a直接作用靶點，敲除LRP5可以抑制hBMSCs的成骨分化，與上調(diào)miR-23a的結(jié)果相一致。因此證實了miR-23a在的成骨分化中通過靶向LRP5，導(dǎo)致Wnt蛋白無法與受體結(jié)合，Wnt信號通路受到抑制，導(dǎo)致hBMSCs的成骨分化受到抑制。MENG等[22]發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-21可提高人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平，促進(jìn)GSK-3β(Wnt信號通路中四聚體的成分之一)的磷酸化，使GSK-3β趨于穩(wěn)定，細(xì)胞中β-catenin的積累增多，激活轉(zhuǎn)錄過程，促進(jìn)成骨分化。這表明miR-21通過間接調(diào)節(jié)Wnt信號通路中的GSK-3β，來調(diào)控干細(xì)胞成骨分化過程。WANG等[23]探究hADSCs發(fā)現(xiàn)miR-26a通過直接靶向GSK-3β，抑制GSK-3β蛋白的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號通路從而促進(jìn)hADSCs的成骨分化。WANG等[24]研究hBMSCs的成骨分化過程的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，使miR-150-3p的表達(dá)上調(diào)，而miR-150-3p可與β-catenin mRNA的3′-UTR結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)β-catenin的水平，抑制hBMSCs的成骨分化。

1.3.3miRNA與非經(jīng)典Wnt信號通路 LI等[25]研究小鼠脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)成骨細(xì)胞分化時，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-26a-5p抑制成骨分化，而抑制內(nèi)源性miR-26a-5p的表達(dá)可促進(jìn)成骨分化。鈣離子熒光探針和Western blot分析顯示，mir-26a-5p抑制Wnt5a、蛋白激酶C(Wnt/Ca2+信號通路的相關(guān)因子)的表達(dá)及鈣離子內(nèi)流，從而抑制小鼠ADSCs的成骨分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的miR-26a-5p通過靶向Wnt5a，抑制非經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)通路Wnt/Ca2+信號通路，抑制ADSCs成骨分化。

盡管眾多研究顯示miRNA通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨分化，但鮮有研究從miRNA的視角出發(fā)探討機(jī)械刺激的生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中干細(xì)胞成骨分化機(jī)制。

2 力學(xué)響應(yīng)miRNA對干細(xì)胞成骨分化的影響

2.1成骨分化中的力學(xué)響應(yīng)miRNA 力學(xué)刺激是細(xì)胞受到的最基礎(chǔ)的刺激之一。近年來，研究發(fā)現(xiàn)力學(xué)因素對干細(xì)胞增殖和成骨分化起著重要的調(diào)節(jié)作用[26]。同時，發(fā)現(xiàn)一些在力學(xué)載荷作用下差異表達(dá)的miRNA，被稱之為力學(xué)響應(yīng)miRNA，可以響應(yīng)力學(xué)刺激、調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與成骨分化。其中大部分miRNA調(diào)控成骨分化的作用靶點未得到驗證，另外有一小部分miRNA作用靶點已被驗證[27]。文獻(xiàn)[28]報道，對體外培養(yǎng)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞施加 12 dyn/cm2、1 h/d的周期性剪切應(yīng)力刺激，基因芯片和實時熒光定量PCR檢測到miR-20a、miR-21、miR-19b、miR-34a、miR-34c、miR-140和miR-200b明顯下調(diào)，推測12 dyn/cm2、1 h/d的流體剪切應(yīng)力可以促進(jìn)成骨分化并且這些明顯下調(diào)的miRNA可能參與成骨分化的調(diào)控。本課題組對體外培養(yǎng)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞施加2 500 με、0.5 Hz不同時長的張應(yīng)變力學(xué)刺激，利用基因芯片和實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-218、miR-191、miR-3070a和miR-33的表達(dá)具有明顯差異，表明這4種miRNAs可能是成骨分化過程中響應(yīng)力學(xué)載荷的潛在調(diào)節(jié)因子[29]。WANG等[30]對MC3T3-E1細(xì)胞施加微重力和10 dyn/cm2、1 h/d流體剪切力這兩種不同類型的力學(xué)載荷刺激誘導(dǎo)成骨分化，作用過后，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)受力前后miR-33-5p證實，Hmga2基因是miR-33-5p的靶基因，可抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。這表明miR-33-5p是一種力學(xué)響應(yīng)miRNA，參與調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞在力學(xué)環(huán)境改變誘導(dǎo)下的成骨分化過程。

2.2力學(xué)刺激經(jīng)Wnt信號通路影響成骨分化 有研究證明，機(jī)械刺激可通過Wnt信號通路影響干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。SHI等[31]對大鼠肌腱干細(xì)胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)施加2%幅度、正弦波型、0.5 Hz、4 h/d的張應(yīng)力刺激，發(fā)現(xiàn)TDSCs向成骨方向分化。用Ras同源基因家族成員A(ras homolog gene family member A，RhoA)的抑制劑下調(diào)RhoA的表達(dá)，抑制了張應(yīng)力刺激下TDSCs的成骨分化；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，張應(yīng)力刺激使TDSCs中的Wnt5a的mRNA水平增加。用小干擾RNA抑制Wnt5a的表達(dá)抑制了張應(yīng)力刺激下TDSCs的成骨分化，而RhoA活化劑可使此過程恢復(fù)。因此，張應(yīng)力刺激通過非經(jīng)典Wnt/PCP(Wnt5a-RhoA)信號通路促進(jìn)TDSCs的成骨分化。ZHANG等[32]發(fā)現(xiàn)給牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)施加100 kpa的靜態(tài)壓力，可使Wnt/β-catenin信號通路激活，從而調(diào)節(jié)PDLSCs成骨分化。DU等[33]證明0.5 Hz、2 000 με、2 h/d張應(yīng)力刺激可激活Wnt/β-catenin信號通路和Wnt/Ca2+信號通路，促進(jìn)hADSCs成骨分化。以上研究均證明機(jī)械刺激對干細(xì)胞的成骨分化作用與Wnt信號通路關(guān)系密切。

2.3力學(xué)響應(yīng)miRNA經(jīng)Wnt信號通路影響成骨分化 LI等[34]對體外培養(yǎng)的小鼠ADSCs施加0.5 Hz、2 000 με、2 h/d周期性張應(yīng)力刺激，從miRNA的角度出發(fā)探討在力學(xué)刺激作用下ADSCs成骨分化的力學(xué)傳導(dǎo)機(jī)制。芯片結(jié)果顯示ADSCs在張應(yīng)力刺激下內(nèi)源性miR-154-5p顯著下調(diào)。熒光素酶報告基因分析證明Wnt11的3′-UTR是miR-154-5p的直接靶點。在力學(xué)刺激作用下，上調(diào)miR-154-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示ADSCs的成骨分化受到抑制；下調(diào)miR-154-5p的表達(dá)，可明顯促進(jìn)ADSCs的成骨分化。進(jìn)一步的實驗證明，miR-154-5p的過表達(dá)通過與Wnt11的mRNA的3′-UTR結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄，降低Wnt11蛋白的濃度，從而抑制非經(jīng)典Wnt/PCP(RhoA-ROCK)信號通路的激活，ADSCs的成骨分化也受到抑制；ADSCs的miR-154-5p下調(diào)后，可激活Wnt/PCP(RhoA-ROCK)信號通路，促進(jìn)ADSCs的成骨分化。簡言之，周期性張應(yīng)力刺激下，miR-154-5p響應(yīng)力學(xué)刺激，經(jīng)Wnt/PCP信號通路靶向Wnt11調(diào)節(jié)ADSCs的成骨分化。

3 小結(jié)與展望

近年來，Wnt信號通路已漸漸為人們所重視，人類某些骨疾病，如骨質(zhì)疏松癥、硬化性骨化病，已證實與異常的Wnt信號通路相關(guān)[35-36]。這些發(fā)現(xiàn)需要研究者們對疾病的發(fā)病機(jī)制與Wnt信號通路在干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更深層次的探索，以尋求治療疾病的新思路和新方法。通過對特異性表達(dá)的miRNA的不斷發(fā)現(xiàn)和靶點的驗證，可能尋找到診斷骨疾病的新方法。另外，力學(xué)載荷是骨組織受到的最基本的刺激之一，在干細(xì)胞向成骨定向分化的過程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。研究miRNA影響干細(xì)胞成骨分化的途徑及其調(diào)控機(jī)制離不開力學(xué)的環(huán)境。然而，現(xiàn)階段對力學(xué)載荷作用下成骨分化過程中特異性表達(dá)的miRNA的研究尚處于起步階段，許多與干細(xì)胞成骨分化相關(guān)的力學(xué)響應(yīng)miRNA的作用靶點和調(diào)控機(jī)制并未得到驗證，明確力學(xué)響應(yīng)miRNAs的功能、調(diào)控機(jī)理、作用靶點、激活抑制因素及不同miRNA之間的相互作用和聯(lián)系將是今后研究的重點。

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