鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC檢測

鐘運超,黃靜靜,張騫予,張 康

(廣西壯族自治區(qū)梧州市人民醫(yī)院/右江民族醫(yī)學(xué)院附屬梧州醫(yī)院腫瘤科，廣西梧州 543000)

鼻咽癌是東南亞最常見的頭頸部惡性腫瘤，放射治療是其主要的治療手段。鼻咽癌在臨床確診時70%以上是中晚期。但中晚期的鼻咽癌5年生存率仍低。主要失敗的原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。免疫治療在降低復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面有獨到的優(yōu)勢。目前，免疫治療已成為惡性腫瘤新的治療方法。而免疫治療主要集中在免疫逃逸的研究。髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)可以通過多種機(jī)制介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此MDSC是繼調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之后的另外一個備受關(guān)注的細(xì)胞，是一群缺乏淋巴細(xì)胞標(biāo)志，未分化完全的骨髓源性異質(zhì)性細(xì)胞群，是樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和(或)粒細(xì)胞前體。MDSC在人外周血的分子標(biāo)志為HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+。MDSC在鼻咽癌領(lǐng)域研究較少。為進(jìn)一步了解MDSC在鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例情況，本研究對45例鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC進(jìn)行了檢測，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2015年7月在本院住院的45例鼻咽癌患者，其中男23例，女22例，年齡60～65歲(平均62.5歲)。均經(jīng)病理組織確診(鼻咽角化癌8例，鼻咽分化型非角化癌14例，未分化型非角化癌23例)。按照國際抗癌聯(lián)盟2009年分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅱ期10例、Ⅲ期15例、Ⅳ期20例。全部病例均在放療前均接受了2周的奈達(dá)鉑聯(lián)合5-FU(NF方案)的誘導(dǎo)化療。全部病例均在第1次化療前及第2周期誘導(dǎo)化結(jié)束后7 d抽取患者外周血，同時簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。另外抽取20例健康志愿者的外周血作為健康對照組。所有研究對象既往無腫瘤和系統(tǒng)疾病病史，臟器功能基本正常，無伴有嚴(yán)重并發(fā)癥等。

1.2流式細(xì)胞儀檢測HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC的表達(dá)水平

1.2.1試劑與儀器 CD11b FITC(美國BD公司)，CD33PE(美國BD公司)，CD14 FITC(美國BD公司)，HLA-DR -APC(美國BD公司)，F(xiàn)ACSTM Permeabilizing Solution2(10×)，購自美國BD公司，BD FACSTM lysing Solution(10×)，購自美國BD公司，PBS由博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，臺式離心機(jī) Labofuge 400R Thermo Fisher產(chǎn)品；BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BECTON DICKNSON)，漩渦混均儀(VORTEX-GENIE)。

1.2.2檢測方法 依據(jù)實驗Panel為樣本管編號，將待用抗體置于冰盒上備用。在試管中按Panel加入試劑規(guī)格要求的膜表面抗體；根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果加入適量的樣本量；低速混勻3 s，室溫孵育20 min；向每個試管中加入紅細(xì)胞裂解液2 mL,混勻，在室溫避光10 min；溫育后立即在室溫離心1 500 r/min，5 min；棄上清液，加2 mL PBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1 500 r/min，5 min，倒掉上清液；加入1 mL破膜劑室溫避光10 min，室溫離心1 500 r/min，5 min,棄上清液；加2 mL PBS洗滌，低速混勻3 s，室溫離心1 500 r/min，5 min，棄上清液；加入細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記抗體，低速混勻3 s，室溫孵育30 min；向試管中加2 mL PBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1 000 r/min，5 min，倒掉上清液；最后加入0.5 mL含1%多聚甲醛PBS重懸，上機(jī)檢測。

2 結(jié) 果

2.1鼻咽癌患者與健康對照組人群外周血MDSC的分布情況 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者外周血和健康對照組人群外周血均存在MDSC，分別是(0.89±0.22)%、(1.19±0.20)%、(1.58±0.39)%和(0.20±0.02)%，鼻咽癌患者外周血存在MDSC比例明顯高于健康對照組人群(F=104.92,P<0.05)。而且隨著Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分期的升高，鼻咽癌患者外周血MDSC比例也逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2不同病理類型的鼻咽癌患者外周血MDSC分布情況 本研究檢測了鼻咽角化癌、鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種不同病理類型患者外周血MDSC分布，結(jié)果顯示：鼻咽角化癌、鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種不同病理類型鼻咽癌患者外周血MDSC比例分別是(0.85±0.23)%、(1.21±0.20)%、(1.46±0.44)%，均高于對照組人群的比例(0.20±0.02)%(F=71.82，P<0.05)。3種不同病理類型的鼻咽癌患者外周血MDSC比例也有差異(P<0.05)，其中以未分化型非角化癌表達(dá)最高，達(dá)(1.46±0.44)%。

2.3NF方案誘導(dǎo)化療前后鼻咽癌患者外周血MDSC分布比例 經(jīng)過2個周期化療后，各期患者外周血的MDSC比例均有顯著降低，其中Ⅱ期化療前(0.89±0.22)%、化療后(0.41±0.24)%(F=5.89，P<0.05)，Ⅲ期化療前(1.19±0.20)%、化療后(0.53±0.21)%(F=9.65，P<0.05)，Ⅳ期化療前(1.58±0.39)%、化療后(0.99±0.31)%(F=7.72，P<0.05)。但其表達(dá)水平仍然高于健康對照組人群。

3 討 論

鼻咽癌是東南亞最常見的頭頸部惡性腫瘤，以廣東、廣西高發(fā)。放射治療是其主要的治療手段。但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是鼻咽癌的主要死因。研究表明：腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫監(jiān)視，免疫耐受，免疫逃逸和免疫無能等免疫紊亂有關(guān)。免疫耐受的持續(xù)存在，引起突變的細(xì)胞對宿主體內(nèi)的免疫監(jiān)視功能的無反應(yīng)性，出現(xiàn)腫瘤逃逸，與其有關(guān)的主要是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)等3種免疫抑制細(xì)胞。其中MDSC是一群髓源祖細(xì)胞中具有免疫抑制功能的細(xì)胞，健康人體內(nèi)的含量很低，不會發(fā)生免疫抑制；但在燒傷，自身免疫疾病，急性或慢性感染等病理狀態(tài)下，血清中MDSC比例會顯著上升，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。而且是處于不同分化階段對腫瘤具有免疫抑制作用的異質(zhì)性細(xì)胞群。在人類細(xì)胞中分子標(biāo)志主要表達(dá)CD11b+CD33+但缺乏CD14-和HLA-DR-[1]。在腫瘤微環(huán)境中MDSC可以誘導(dǎo)局部免疫耐受[2]，其免疫耐受不僅與腫瘤細(xì)胞本身因素如腫瘤抗原調(diào)變、MHC分子、共刺激分子表達(dá)降低有關(guān)，也與腫瘤引起的機(jī)體免疫功能異常關(guān)系密切。主要通過以下幾種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性的細(xì)胞免疫耐受，包括釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素(IL)-10等細(xì)胞因子誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)，Ⅱ型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生間接抑制T細(xì)胞增殖和活性；清除半胱氨酸可以抑制正常APC對T細(xì)胞的激活；通過產(chǎn)生活性氧，一氧化氮合成酶和精氨酸酶抑制T細(xì)胞增殖，促進(jìn)T細(xì)胞凋亡；產(chǎn)生膜結(jié)合型TGF-β以直接方式抑制T細(xì)胞活性等[3]。另外MDSC還可以在腫瘤部位分化成調(diào)節(jié)性DC，后者引起的T細(xì)胞分泌IFN-r能力下降[4]。而抑制或殺傷腫瘤誘導(dǎo)的MDSC可以提高T細(xì)胞功能[5]。大量研究表明：鼻咽癌患者出現(xiàn)一系列免疫功能紊亂，造成機(jī)體對微生物及其毒素的反應(yīng)發(fā)生異常改變，免疫異常對鼻咽癌細(xì)胞的種植、黏附、增生具有直接或間接作用，從而誘發(fā)鼻咽癌的不斷發(fā)展與惡化。 鼻咽癌患者外周血的MDSC通過在數(shù)量上的增加等因素發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[6]。研究報道在荷瘤小鼠和腫瘤患者的外周血中可以檢測到MDSC細(xì)胞明顯升高，并且具有很強(qiáng)的免疫抑制作用[7-8]。而健康者則不具有或僅有很弱的免疫抑制作用。 腫瘤患者外周血MDSC比例顯著高于健康人群，其MDSC數(shù)量與腫瘤分期呈正相關(guān)[9]，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也與腫瘤患者外周血MDSC數(shù)量顯著增加有關(guān)[10-11]，從而直接參與腫瘤免疫逃逸和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC比例明顯高于健康對照人群的HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC比例(P<0.05)；隨分期的上升而明顯增多(P<0.05)，與文獻(xiàn)[12]報道相似?？赡芤驗槟[瘤源性因子(TDFs)通過STATS信號途徑促進(jìn)MDSC的募集和擴(kuò)增有關(guān)。提示這群細(xì)胞在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，可以用于判斷病情，協(xié)助臨床分期。進(jìn)一步對鼻咽角化癌，鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種類型的MDSC比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鼻咽角化癌，鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種類型患者外周血MDSC比例均高于健康對照組人群(P<0.05)。值得注意的是，在3種不同病理類型之間，其外周血MDSC比例也存在差異(P<0.05)，其中以未分化型非角化癌表達(dá)最高達(dá)(1.46±0.44)%。說明腫瘤分化程度越低，外周血中MDSC比例增高越明顯。與文獻(xiàn)[13-14]報道基本一致。提示其對判斷患者預(yù)后具有一定意義。本研究也發(fā)現(xiàn)化療在一定程度上能降低MDSC水平，兩個周期NF方案化療前后比較有顯著差異(P<0.05)，但其結(jié)果仍然比健康對照組高。說明誘導(dǎo)化療是能通過減少MDSC的比例，能部分恢復(fù)免疫功能。

綜上所述，腫瘤患者免疫功能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，以及對患者預(yù)后的影響已經(jīng)受到廣大學(xué)者們的廣泛關(guān)注，本研究對鼻咽癌不同期別、不同病理類型及誘導(dǎo)化療前后鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例做了初步研究，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例明顯升高，提示可能與鼻咽癌免疫逃避有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

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