針刺對慢性腦缺血大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元鈣通道Cav1.3表達(dá)及凋亡的影響*

郭 森，魏 萌，楊松鶴，喬躍兵、2

（1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000；2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校）

針剌是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)特有的一種治療手段，大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究都已證明，針刺可通過抑制炎性反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激損傷、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腦血管再生等途徑保護(hù)神經(jīng)元[1-3]。也有研究指出[4]，電針刺激“四白”穴可以誘發(fā)大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元中有衣小泡的產(chǎn)生，有衣小泡在神經(jīng)元發(fā)育及對抗損傷的過程中都發(fā)揮了重要作用[5-6]，但作用機(jī)制仍不明確。本研究通過觀察針刺腦缺血大鼠“四白”穴后三叉神經(jīng)脊束核中鈣通道Cav1.3蛋白表達(dá)的變化和神經(jīng)元的凋亡情況，探討腦損傷后電針作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Wistar大鼠，雄性，200g-220g。36只大鼠隨機(jī)分為3組，針刺組、缺血對照組和假手術(shù)組，每組12只。針刺組和缺血對照組大鼠阻斷左側(cè)頸總動(dòng)脈和雙側(cè)椎動(dòng)脈建立模型，假手術(shù)組只暴露相應(yīng)動(dòng)脈不予阻斷；針刺組大鼠于阻斷血管24h后給予針刺處理。

1.2 主要設(shè)備及試劑 G6805-2A型電針治療儀（上海華誼醫(yī)用儀器廠），H7650透射電子顯微鏡（日本日立公司），冰凍切片機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；兔源性抗Cav1.3抗體（美國Abcam公司），TUNEL試劑盒（瑞士羅氏公司）。

1.3 大鼠慢性腦缺血模型的制備 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg），仰位固定，頸部正中切口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎切斷；大鼠俯位固定，頸部后正中線切口，暴露第一頸椎橫突孔，電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈。

1.4 大鼠針刺方法 針刺組大鼠于阻斷血管24h后給予針刺處理。于大鼠第二排剛髭中間處[6]（相當(dāng)于人的“四白”穴）刺入電針，接通電針治療儀，選擇疏密波（40Hz/s，輸出電壓5V），連續(xù)針刺3h，1次/天，針刺15天。

1.5 標(biāo)本的采集及指標(biāo)檢測 每組12只大鼠，隨機(jī)選取其中的6只用于制作光鏡標(biāo)本，其余6只用于制作電鏡標(biāo)本。

1.5.1 光鏡標(biāo)本的采集及指標(biāo)檢測：大鼠于腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉（300mg/kg），4%多聚甲醛400ml固定，取出第四腦室底髓紋至枕骨大孔部分的腦組織，后固定過夜，30%蔗糖浸至下沉后行冠狀切面冷凍切片（厚20μm）。

⑴免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測鈣通道Cav1.3蛋白的表達(dá)，一抗工作濃度1：200，DAB顯色，以神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)有黃褐色顆粒為Cav1.3陽性神經(jīng)元。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析，用三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)染色的平均光密度（OD）值作為鈣通道Cav1.3蛋白相對表達(dá)量的指標(biāo)。

⑵神經(jīng)元凋亡的檢測：按TUNEL試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，D A B顯色。細(xì)胞中有黃褐色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡神經(jīng)元。每只大鼠隨機(jī)選取10個(gè)200倍光鏡視野，以10個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞的平均值，作為該大鼠凋亡神經(jīng)元的數(shù)量。

1.5.2 電鏡標(biāo)本的采集及染色：大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉（300mg/kg），4%多聚甲醛、1%戊二醛混和液400ml固定，取出延髓，參照《大鼠腦立體定位圖譜》切取三叉神經(jīng)脊束核部分。所得標(biāo)本于25%戊二醛中固定4h，0.1mol/L的PBS沖洗5次，1%鋨酸固定2h，0.1mol/L的PBS漂洗12h，丙酮梯度脫水，Epon812浸透包埋，超薄切片，鈾鉛染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核鈣通道Cav1.3蛋白的表達(dá)針刺組大鼠三叉神經(jīng)脊束核鈣通道Cav1.3蛋白表達(dá)明顯高于缺血對照組，但仍低于假手術(shù)組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見附表：

附表 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核鈣通道Cav1.3蛋白表達(dá)和神經(jīng)元凋亡情況（± s，n=6）

附表 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核鈣通道Cav1.3蛋白表達(dá)和神經(jīng)元凋亡情況（± s，n=6）

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05；與缺血對照組比較：△P＜0.05

組別 Cav1.3蛋白表達(dá) 神經(jīng)元凋亡數(shù)量假手術(shù)組 173.76±7.52 5.35±0.82缺血對照組 119.51±6.17* 17.15±1.27*針刺組 136.9±6.52*△ 12.07±1.35*△

2.2 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元凋亡情況 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)均可檢測到凋亡神經(jīng)元，神經(jīng)元凋亡數(shù)量：缺血對照組＞針刺組＞假手術(shù)組，各組間凋亡神經(jīng)元數(shù)量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

2.3 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察 假手術(shù)組大鼠，神經(jīng)元細(xì)胞核核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)均勻；胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，排列規(guī)則，線粒體豐富（圖1）。缺血對照組大鼠，細(xì)胞核變形，核膜內(nèi)陷形成核袋或假包涵體（圖2）。針刺組大鼠，神經(jīng)元缺血性改變較缺血對照組輕；神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)則（圖3）；在胞質(zhì)內(nèi)可見到有衣小泡，多呈圓形，質(zhì)膜外多附有毛刺狀外衣，大部分有衣小泡位于細(xì)胞膜附近（圖4）。

附圖 大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

3 討論

L-型鈣通道Cav1.3是電壓依賴性鈣通道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，參與鈣穩(wěn)態(tài)、激素分泌和基因表達(dá)等多種功能的調(diào)控[7-8]。以往認(rèn)為，神經(jīng)元缺血后L型鈣通道的開放是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載及神經(jīng)元死亡的重要因素[9]。但隨著對神經(jīng)元缺血損傷研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低同樣可以導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，尤其是在慢性腦缺血的過程中，L-型鈣通道表達(dá)的減少也是造成神經(jīng)元凋亡的重要因素[10]。因此，對缺血后神經(jīng)元L-型鈣通道的保護(hù)可能成為減少神經(jīng)元凋亡的有效手段。

針剌作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)特有的一種治療手段，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于缺血性腦血管疾病的治療，且已被證明可通過減輕氧化應(yīng)激損傷、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腦血管再生等途徑在缺血性腦血管疾病中發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[1-3]?？紫橛竦劝l(fā)現(xiàn)[4]，電針刺激大鼠“四白”穴可誘發(fā)三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元中有衣小泡的產(chǎn)生，這些有衣小泡的形成主要與神經(jīng)元發(fā)育和對抗損傷因素的某些過程有關(guān)。本研究超微結(jié)構(gòu)觀察亦發(fā)現(xiàn)了有長小泡的產(chǎn)生。另外，本研究還觀察了針刺后慢性腦缺血大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元鈣通道Cav1.3表達(dá)的改變及神經(jīng)元的凋亡情況，結(jié)果顯示，針刺組大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元鈣通道Cav1.3蛋白的表達(dá)明顯高于缺血對照組、凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯低于缺血對照組。考慮可能機(jī)制為，電針誘發(fā)產(chǎn)生的有衣小泡介導(dǎo)了細(xì)胞膜鈣通道Cav1.3在不同神經(jīng)元之間的交換和循環(huán)，防止了受缺血影響較嚴(yán)重的神經(jīng)元鈣通道Cav1.3表達(dá)的過度減少，進(jìn)而阻止神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)的破壞和凋亡的發(fā)生。

綜上所述，針刺雖能抑制大鼠腦缺血后三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元鈣通道Cav1.3表達(dá)的減少和神經(jīng)元凋亡，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

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