通過在低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)、優(yōu)化碳/能量代謝模式促進(jìn)畢赤酵母表達(dá)Monellin

槐強(qiáng)強(qiáng)，賈祿強(qiáng)，丁健，陳珊珊，孫佼文，史仲平

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

Monellin是西非植物Dioscoreophyllum cumminsii漿果中的一種天然甜味蛋白，它的甜度是相同質(zhì)量蔗糖的 3 000倍[1]。與其他的甜蛋白 (如pentadin，thaumatin等) 相類似，monellin也是一種非碳水化合物甜味劑，對(duì)于那些患有嚴(yán)重糖尿病但卻嗜好傳統(tǒng)糖類食品的人群而言是一種健康食品[2]。Monellin可以制作成安慰甜味劑或甜酵母片供糖尿病人食用[3-4]。Monellin純品價(jià)格昂貴，Sigma公司銷售的純度為 95%的 monellin價(jià)格為$100/100 mg (http://www.zhenghe.cn/JiShuTong/CG_TechnologyInfo_T.aspx?key=24ccc46229984a0190 28ee1a95034ac3)。Monellin也能夠通過微生物的生化反應(yīng)方法合成。在最新報(bào)道中，Chen等利用含有sacB啟動(dòng)子和信號(hào)肽的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)monellin，monellin最大濃度達(dá)到0.29 g/L[5]。Liu等在重組釀酒酵母中表達(dá) monellin，monellin的最高濃度為0.675 g/L[6]。Leone等利用重組大腸桿菌表達(dá)monellin，其濃度大約為0.18 g/L[7]。

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母被認(rèn)為是一種高效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[8]，該系統(tǒng)具有分子遺傳操作方便、細(xì)胞易于達(dá)到高密度、外源蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較高的特性。重組畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的過程主要分為兩個(gè)階段：生長(zhǎng)階段，以甘油為碳源、獲取大量的功能性細(xì)胞；誘導(dǎo)階段，通過流加甲醇來誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白[9]。通常情況下，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到高密度 (100-130 g DCW/L) 時(shí)，將碳源從甘油切換成甲醇，并將甲醇濃度維持在適宜水平開始誘導(dǎo)[10-11]。然而，這種“標(biāo)準(zhǔn)”型外源蛋白表達(dá)策略有以下缺點(diǎn)：1) 高耗氧特性，通空氣供氧、培養(yǎng)后期/誘導(dǎo)期的溶氧濃度 (DO) 無法控制；2) 如果追求高細(xì)胞濃度，在細(xì)胞培養(yǎng)后期乙醇會(huì)積累，導(dǎo)致外源蛋白生產(chǎn)表達(dá)的不穩(wěn)定[12]；3) 在較低溫度 (20 ℃) 下誘導(dǎo)有利于外源蛋白的表達(dá)，可以增強(qiáng) AOX的活性，緩解目標(biāo)蛋白的降解，但是低溫誘導(dǎo)會(huì)增加熱交換壓力與氧氣供應(yīng)的負(fù)擔(dān)/成本[13]，特別是在夏季；4) 能量(NADH) 物質(zhì)的無效生成可造成過多/無效的甲醇消耗，降低整個(gè)發(fā)酵性能[9,14]。為了解決上述問題，人們提出了另一種在低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)的操作策略。Wang等使用該策略表達(dá)堿性果膠酶，發(fā)現(xiàn)在低細(xì)胞濃度56.7 g DCW/L下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，蛋白生產(chǎn)效率 (Qv) 最大，比在細(xì)胞濃度83.39或124.9 g DCW/L啟動(dòng)誘導(dǎo)的Qv高11.6%和 18.4%[15]。Jia等報(bào)道指出，在低細(xì)胞濃度60 g DCW/L時(shí)啟動(dòng)誘導(dǎo)，同時(shí)將誘導(dǎo)溫度控制在22 ℃的較低水平，提高了聚 (乙烯醇) 脫氫酶的產(chǎn)量，且DO一直處于可控范圍 (5%–20%) 內(nèi)[16]。然而，在低/高細(xì)胞濃度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)時(shí)，甲醇/能量變化模式的相關(guān)報(bào)道很少，誘導(dǎo)性能得到優(yōu)化的機(jī)制/機(jī)理尚不明確。

文中分析了在不同細(xì)胞濃度 (50、100 g DCW/L)及其不同的誘導(dǎo)溫度 (20、30 ℃) 下，畢赤酵母表達(dá)monellin的甲醇/能量代謝模式，試圖解釋在較低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)的控制策略可以促進(jìn)monellin表達(dá)的原因，為畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的過程控制提供一些有用信息。

1 材料與方法

1.1 菌株

甲醇利用慢型重組畢赤酵母Pichia pastorisKM71菌株由武漢輕工業(yè)大學(xué)構(gòu)建并提供。表達(dá)載體為pPICZαA，重組質(zhì)粒為pPICZαA-Mon。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基 (g/L) 的組成如下所示：YPD培養(yǎng)基(葡萄糖 20，酵母提取物 10，蛋白胨 20) 用于種子培養(yǎng)。分批發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油 20，(NH4)2SO45，H3PO42 (%，V/V)，MgSO41，CaSO40.1，K2SO41；PTM110 (mL/L)，pH 6.0。生長(zhǎng)流加培養(yǎng)基：甘油 500，(NH4)2SO40.5，KH2PO40.5，MgSO40.03；PTM110 (mL/L)，pH 6.0。誘導(dǎo)流加培養(yǎng)基：純甲醇；PTM110 (mL/L)，pH 6.0。

1.3 在 5 L發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)畢赤酵母表達(dá)monellin

畢赤酵母分批培養(yǎng)在5 L發(fā)酵罐 (百侖生物科技有限公司，BLBIO-5GJ-3-H) 中進(jìn)行，由1個(gè)顯示屏/控制柜同時(shí)驅(qū)動(dòng)2個(gè)5 L發(fā)酵罐。初始裝液量為2.0 L。接種量和通氣量分別為14% (V/V)和 3 vvm。在細(xì)胞生長(zhǎng)期，手動(dòng)提高攪拌轉(zhuǎn)速至700 r/min將DO維持在10%以上。采用標(biāo)準(zhǔn)或改進(jìn)型 DO-Stat[12]策略進(jìn)行甘油流加，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)。如果最大攪拌轉(zhuǎn)速下，DO基線仍不能維持在10%以上，則需要通入純氧。用5% (V/V)的氨水將pH維持在6.0。甘油/乙醇 (副產(chǎn)物) 完全耗盡后，開始流加純甲醇，進(jìn)入誘導(dǎo)期，并根據(jù)需要將誘導(dǎo)溫度控制在30 ℃或20 ℃，pH維持不變。使用配有多通道A/D-D/A轉(zhuǎn)換器 (臺(tái)灣研華科技有限公司，PCL-812PG) 的工控機(jī)，根據(jù)甲醇 (上海蘇泊公司，F(xiàn)C-2002) 和DO電極在線測(cè)量結(jié)果驅(qū)動(dòng)蠕動(dòng)泵 (河北保定蘭格有限公司，BT00-50M) 進(jìn)行甲醇/甘油流加。在誘導(dǎo)期，采用甲醇ON-OFF控制策略將甲醇濃度控制在5–7 g/L的范圍。甲醇電極也能夠在線測(cè)量生長(zhǎng)期的乙醇濃度并且與DO測(cè)量[12]相結(jié)合來調(diào)節(jié)甘油流加速率。利用尾氣分析儀 (韓國 Lokas公司，LKM2000A) 在線檢測(cè)尾氣 (通入空氣) 中 O2和CO2分壓。O2消耗速率 (OUR) 和 CO2釋放速率(CER) 可通過標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算公式[17]確定。

1.4 測(cè)量細(xì)胞/甲醇/monellin濃度和相應(yīng)的生長(zhǎng)/消耗/合成速率

細(xì)胞濃度通過測(cè)量波長(zhǎng)600 nm (OD600) 處的吸光值測(cè)定，根據(jù)細(xì)胞干重 (DCW/L) 與OD600值的線性關(guān)系曲線 (DCW/L=0.25×OD600) 計(jì)算DCW/L。甲醇和乙醇濃度通過氣相色譜儀 (上海精密科學(xué)儀器有限公司，GC112A，F(xiàn)ID檢測(cè)器；Alpha-Col AC20毛細(xì)管柱，澳大利亞SGE國際有限公司) 進(jìn)行測(cè)定。中間代謝產(chǎn)物甲醛和甲酸的濃度通過高效液相色譜儀 (反向 ZORBAX SB C18柱，254 nm，紫外檢測(cè)器) 進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相是 20 mmol/L的 Na2PO4溶液 (99%) 和乙腈(1%)。進(jìn)樣量 10 μL，柱溫為 28 ℃。電泳板的Marker泳道加入20 μL分子量已知的蛋白溶液。聚丙烯酰胺凝膠電泳 (12%分離膠) 以標(biāo)準(zhǔn)分子量作為基準(zhǔn)直至溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的底部。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后，通過G:Box生物成像系統(tǒng)和基因工具軟件 (英國 SynGene公司) 對(duì)發(fā)酵moenllin的濃度進(jìn)行定量。每個(gè)條帶掃描三次取平均值作為定量結(jié)果。此外，以10 g/L的蔗糖溶液為對(duì)照，對(duì)無細(xì)胞發(fā)酵上清液進(jìn)行甜味檢測(cè)。電子天平 (上海?？惦娮觾x器廠，JA1102) 通過RS232通信接口與工控機(jī)連接，通過測(cè)量甲醇流加瓶的重量減少量在線檢測(cè)甲醇消耗量 (g/L)。細(xì)胞濃度 (X)、甲醇消耗量 (S) 和monellin濃度(P) 分別與獨(dú)立變量 (誘導(dǎo)) 時(shí)間進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，以濃度對(duì)時(shí)間t進(jìn)行微分 (dX/dt，dS/dt，dP/dt)，確定細(xì)胞生長(zhǎng)/甲醇消耗/monellin合成的比速率。

1.5 碳分配比率計(jì)算

如圖 1所示，碳 (甲醇) 代謝用于 4個(gè)不同部分：細(xì)胞生長(zhǎng)、維持代謝、monellin合成和供能。其中，根據(jù)經(jīng)典生物工程教科書[18-20]，用于細(xì)胞生長(zhǎng)和維持代謝的碳流比率可由式1確定。

式中的ν、μ、YX/S和m分別表示甲醇比消耗速率、細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、細(xì)胞對(duì)甲醇的得率系數(shù)和維持代謝常數(shù)。

這里，X和S分別表示細(xì)胞和底物濃度；F是甲醇流加速率，由甲醇濃度自動(dòng)控制系統(tǒng)確定；V是發(fā)酵液體積；SF是甲醇流加濃度；k和k-1分別代表當(dāng)前取樣時(shí)刻和上一個(gè)取樣時(shí)刻；ΔT是取樣間隔是取樣間隔內(nèi)細(xì)胞的平均濃度。由于甲醇濃度基本控制在 5 g/L左右的低水平(dS/dt≈0)，且使用純甲醇流加，SF–S≈SF，SF就是甲醇的密度 (800 g/L)。由于直接添加100%的純甲醇，添加量較少，且逃液量有限。通過適度調(diào)控采樣頻率和體積可以將發(fā)酵液體積V控制恒定水平。以μ和ν為橫縱坐標(biāo)，對(duì)不同誘導(dǎo)條件下的ν和μ數(shù)據(jù)作圖，從直線的斜率可以得到用于細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)底物的得率 (YX/S)。再根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15,21]，畢赤酵母細(xì)胞中的碳含量在50%左右，因此，將原有的YX/S乘50%進(jìn)行計(jì)算，可得到真正用于細(xì)胞生長(zhǎng)的碳流 (甲醇消耗) 比率。在計(jì)算細(xì)胞維持代謝能 (mXE) 方面，仍沿用公式1來進(jìn)行計(jì)算，但通過對(duì)該公式變形來計(jì)算真正意義上的細(xì)胞維持代謝能 (mXE)：

式3是公式1的轉(zhuǎn)化版，即細(xì)胞對(duì)底物得率(YX/S) 必須要扣除用于細(xì)胞維持代謝能 (mXE) 的碳流比例。但是，由于誘導(dǎo)過程中 1/ν和μ/ν均在變化，因此，mXE不再是一個(gè)數(shù)值而是處在一定范圍內(nèi)。因此，我們利用下式計(jì)算mXE的平均值，得到用于維持代謝能的碳流比例。

式中，mXE(t)、ΔT、T分別是特定時(shí)刻計(jì)算得到的細(xì)胞維持代謝能 (碳流比率)、采樣和計(jì)算間隔、以及總誘導(dǎo)時(shí)間。另一方面，如圖1所示，一部分甲醇必須通過異化產(chǎn)能 (供能) 途徑A合成能量物質(zhì) (NADH)，同時(shí)釋放出 CO2。供能途徑中總的甲醇消耗/代謝比率 (ε)、包括用于monellin合成εP和細(xì)胞維持代謝m的供能比例，可由式5計(jì)算得到。

式中的CER，tf和ATMeOH分別表示CO2釋放速率、總誘導(dǎo)時(shí)間和甲醇總消耗量。最后，用于monellin合成 (前體) 的甲醇消耗比率 (γ) 可由式6確定。

圖1 甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)monellin簡(jiǎn)化代謝途徑Fig.1 Simplified methanol metabolic pathways by P.pastoris for monellin production.

2 結(jié)果與討論

2.1 低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)促進(jìn)monellin表達(dá)

在5 L發(fā)酵罐中共進(jìn)行了4批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。批次#1–2中，細(xì)胞達(dá)到高密度 (100 g DCW/L左右)后開始誘導(dǎo)。在批次#3–4中，當(dāng)細(xì)胞濃度在低密度 (50 g DCW/L左右) 時(shí)開始誘導(dǎo)。批次#3–4中，通空氣，采用傳統(tǒng) DO-Stat控制策略進(jìn)行甘油流加。但是，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到50-60 g DCW/L以后，DO下線 (基線) 降低到接近于0的水平，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停止，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率接近于 0。因此，在批次#3中，當(dāng)細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，立即啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，進(jìn)入誘導(dǎo)期。而在批次#1中，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到50 g DCW/L左右、細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，將供氧模式從通空氣改為通純氧，以確保DO基線高于某臨界值 (約 5%)。如圖 2所示，通入純氧后，DO平均水平升高，細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)，但乙醇也開始積累。有報(bào)道指出[12]，乙醇的歷史積累嚴(yán)重破壞重組畢赤酵母的功能骨架，嚴(yán)重影響外源蛋白的表達(dá)和發(fā)酵穩(wěn)定性。因此，本研究中采用改良型 DO-Stat[12]策略，將乙醇濃度控制在低水平 (2 g/L以下)。如圖2所示，發(fā)酵批次#1中，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到50-60 g DCW/L后，通純氧并采用改良型 DO-Stat策略流加甘油，細(xì)胞最終可以達(dá)到高密度 (100 g DCW/L)，且最大乙醇濃度低于2.1 g/L。因此，理論上批次#1可以實(shí)現(xiàn)monellin的高效表達(dá)。

圖2 不同甘油流加/通氣控制策略下細(xì)胞生長(zhǎng)期內(nèi)的DO、細(xì)胞和乙醇濃度的變化Fig.2 Time courses of DO, cell, ethanol concentrations within growth phase with different glycerol feeding/aeration strategies.

具體的誘導(dǎo)操作策略如下：批次#1-2在高細(xì)胞濃度 (100 g DCW/L) 下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度分別是 30 ℃ (批次#1) 和 20 ℃ (批次#2)；批次#3-4在低細(xì)胞濃度 (50 g DCW/L) 下開始誘導(dǎo)，并將誘導(dǎo)溫度控制在30 ℃ (批次#3) 和20 ℃ (批次#4)。批次#3中，monellin濃度達(dá)到了2.62 g/L的最高水平；其次是批次#4，monellin濃度為1.87 g/L (圖 3C)。但是，當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)策略 (高細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)) 時(shí)，monellin濃度分別為1.04 g/L (批次#2，20 ℃) 和 0.54 g/L (批次#1，30 ℃)，發(fā)酵性能很差。上述結(jié)果也總結(jié)歸納于表1中。此外，收集無細(xì)胞發(fā)酵上清液檢測(cè)其甜度。雙盲測(cè)試結(jié)果表明，批次#3中收集得到的上清液甜度明顯高于其他批次中的上清液甜度。圖 3B和3D是批次#1-4中monellin濃度隨時(shí)間變化的SDS-PAGE圖，Monellin分子量為10.7 kDa。批次#3-4中，monellin表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增加，而批次#1-2中的monellin濃度基本不變。此外，無論胞內(nèi)還是胞外，甲醇代謝的中間毒副產(chǎn)物甲醛和甲酸均未檢測(cè)到 (數(shù)據(jù)未顯示)。

如圖 1所示，碳 (甲醇) 代謝用于 4個(gè)不同部分：細(xì)胞生長(zhǎng)、維持代謝、monellin合成和供能。碳流分配比率可由公式1-6確定。另外，我們假定monellin比合成速率 (ρ) 和細(xì)胞比生長(zhǎng)速率 (μ) 遵從Luedeking-Piret模型，即

Luedeking-Piret模型是關(guān)聯(lián)目標(biāo)代謝產(chǎn)物比合成速度與細(xì)胞比生長(zhǎng)速度之間關(guān)系的、比較公認(rèn)的基礎(chǔ)模型。因此，碳代謝和monellin合成模式可由式1-7確定。

一般認(rèn)為，乙醇、乳酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)屬于代謝產(chǎn)物合成/細(xì)胞生長(zhǎng)完全耦聯(lián)型，氨基酸、某些有機(jī)酸等發(fā)酵生產(chǎn)屬于代謝產(chǎn)物合成/細(xì)胞生長(zhǎng)半耦聯(lián)型，而抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)則屬于代謝產(chǎn)物合成/細(xì)胞生長(zhǎng)非耦聯(lián)型。

2.2 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá) monellin的碳代謝模式

圖4是不同誘導(dǎo)策略下的μ、ν和ρ的變化模式。其中，圖4B和圖4C也間接顯示了二級(jí)發(fā)酵參數(shù)YX/S、α和β的差異。表2則總結(jié)歸納了不同誘導(dǎo)策略 (批次) 下主要二級(jí)發(fā)酵參數(shù)YX/S、mXE、εP、γ、α和β的差異和變化。

圖3 不同誘導(dǎo)策略下monellin濃度和SDS分析結(jié)果Fig.3 Monellin concentrations and SDS analysis results with different induction strategies.

表1 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá)monellin的發(fā)酵性能比較Table 1 Fermentation performance of monellin synthesis by Pichia pastoris using different induction strategies

圖4 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá)monellin的碳代謝模式Fig.4 Carbon metabolism modes for monellin synthesis by P.pastoris with different induction strategies.

上述結(jié)果表明，采用低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)的策略，1) 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率高但用于細(xì)胞生長(zhǎng)的碳流較少 (圖4B中，斜率1/YX/S較大)。2) 30 ℃下monellin的比合成速率與細(xì)胞比生長(zhǎng)速率完全耦聯(lián)、耦聯(lián)系數(shù) (α) 最大，且細(xì)胞比生長(zhǎng)速率μ也較高 (第二大)，這可能是批次#3中 monellin濃度達(dá)到最大的一個(gè)原因。3) 甲醇供能途徑A中用于能量NADH合成的甲醇消耗比率εP較大 (用于為 monellin合成供能)。低細(xì)胞濃度下誘導(dǎo)，εP=22.7%-29.2%；高細(xì)胞濃度下誘導(dǎo)，εP=14.0%-19.0%，整個(gè)代謝過程中的細(xì)胞/monellin合成有足夠的能量支撐。4) 30 ℃下用于monellin前體合成的甲醇利用比率γ最大(65.2%)，而且與較高的能量支撐相匹配。此時(shí)，應(yīng)該有較多的前體物質(zhì) (氨基酸等)[22]可用于甜味蛋白monellin合成。

需要說明的是，在批次#1中，由于誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生的 monellin立即降解 (圖 3A)，數(shù)據(jù)不符合 Luedeking-Piret模型，因此相應(yīng)參數(shù)未在圖 4和表2中顯示。

2.3 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá) monellin的能量利用效率

能量利用效率是增強(qiáng)畢赤酵母表達(dá) monellin的另一個(gè)重要因素。碳代謝和能量代謝必須相匹配才能提高發(fā)酵性能。如表2所示，批次#1和批次#3中走向前體物質(zhì)合成途徑的碳流比率相差較大 (γ=48%，批次#1；γ=65%，批次#3)，走向能量代謝 (用于 monellin合成) 的碳流比率相差也很大 (批次#1，εP=14%；批次#3，εP=23%)。因此，批次#3中的甲醇/能量代謝比例是比較匹配的。另外，能量利用效率在畢赤酵母代謝甲醇的過程中是非常重要的。該效率取決于氧化磷酸化反應(yīng)中的氧氣消耗速率，并直接影響到用于細(xì)胞生長(zhǎng)/monellin合成的能量供給-ATP再生速率。如圖1所示，在甲醇代謝過程中有兩個(gè)耗氧步驟。第一步是甲醇經(jīng)AOX酶的催化生成甲醛 (HCHO)，這是甲醇代謝的中樞和第一個(gè)代謝反應(yīng)。這個(gè)步驟中O2消耗速率由式9確定。

表2 不同誘導(dǎo)策略下、畢赤酵母表達(dá)monellin發(fā)酵過程的主要二級(jí)發(fā)酵參數(shù)Table 2 Major secondary parameters in monellin fermentation by Pichia pastoris using different induction strategies

這里T和t分別表示溫度和誘導(dǎo)時(shí)間。第二步耗氧反應(yīng)發(fā)生在氧化磷酸化反應(yīng)過程中，該過程將供能途徑A中生成的NADH轉(zhuǎn)化為ATP，此步驟中的 O2消耗速率可由甲醇消耗速率rMeOH和OUR并結(jié)合公式11計(jì)算得到。

式中的rMeOH、rFNADH、rCNADH、rATP、OUR和 CER分別表示甲醇消耗速率、NADH合成速率、NADH利用速率、氧化磷酸化反應(yīng)中的ATP再生速率、O2消耗速率和CO2釋放速率。

理論上ATP再生速率rATP取決于公式14中假設(shè)不同誘導(dǎo)溫度下P/O比例恒定不變，ATP再生速率rATP可由rATP=(P/O)rCNADH表示。這里，我們定義一個(gè)新參數(shù)η來表示能量利用效率。

即η(rCNADH/rFNADH) 定義為畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時(shí)的能量利用效率。理論上，η=1表明氧化磷酸化過程可以將所有來源于甲醇異化產(chǎn)能途徑的NADH完全氧化，再生ATP，為外源蛋白合成/細(xì)胞生長(zhǎng)-維持代謝提供能量。如圖1所示，如果η>1，表明NADH的需求量高于其生成量，這意味著 NADH的需求量是受限的，最大 NADH需求量rCNADH只能等于其生成量rFNADH。針對(duì)η的取值，我們進(jìn)行如下聚類：如果η≥1，途徑A中生成的 NADH可完全 (100%) 用于 ATP的再生，為 monellin合成/細(xì)胞生長(zhǎng)-維持代謝提供能量；如果0.8<η<1.0，能量利用效率被認(rèn)為處于較高水平；如果η≤0.8，表明能量利用效率處于低水平，產(chǎn)生的NADH不能有效地用于ATP再生為monellin合成/細(xì)胞生長(zhǎng)-維持代謝提供能量。圖5A和表 2是批次#1–4中整個(gè)誘導(dǎo)階段每小時(shí)間隔內(nèi)的η聚類結(jié)果。如該圖和表所示，批次#3 (低細(xì)胞濃度誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度30 ℃) 中高η(η≥1，非常高；0.8<η<1.0，較高) 的聚類比例是最高的(η≥1，49%；0.8<η<1.0，40%；共 89%)。批次#1 (較高細(xì)胞濃度啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度30 ℃)中低η(η≤0.8，100%；0.8<η<1.0和η≥1.0，0%)聚類比例是 100%。批次#2和批次#4中高η(0.8<η<1.0+η≥1.0) 的聚類比例分別是 34%和63%，介于批次#1和批次#3之間。圖5B是兩個(gè)極端批次 (批次#1和批次#3) 中η隨時(shí)間的變化情況。

圖5 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá)monellin過程的能量 (NADH) 效率η分布模式Fig.5 Energy (NADH) distribution patterns η in monellin production by P.pastoris with different induction strategies.

如圖3和表1所示，批次#1中表達(dá)monellin濃度最低，且誘導(dǎo)表達(dá)后立即降解。原因可能有兩個(gè)：1) 批次#1中，用于供能/蛋白合成的甲醇利用比例 (εP/γ) 較低，εP/γ=0.29，供能/蛋白合成的碳流比率低；而批次#3 的εP/γ較高，εP/γ=0.35，供能/蛋白合成的碳流比率相對(duì)匹配。2) 批次#1中的NADH利用效率η低于0.8 (η≤0.8) 的比例為 100%，極低的能量效率是導(dǎo)致最低 monellin濃度的另一個(gè)重要原因。相反，批次#3中、η數(shù)據(jù)的絕大多數(shù) (89%) 都高于0.8 (η≥0.8)，表明途徑A中產(chǎn)生的NADH能高效地用于ATP再生以支撐monellin合成。綜合這兩個(gè)因素，發(fā)酵批次#3的monellin濃度達(dá)到2.62 g/L的最高水平。

需要指出的是，η>1是不符合實(shí)際的 (η=1是理論上的最大值)。不符實(shí)際數(shù)據(jù) (η>1) 的產(chǎn)生源于OUR、CER和甲醇消耗速率的在線測(cè)量。因?yàn)檫@些在線測(cè)量系統(tǒng)是獨(dú)立的，同時(shí)在實(shí)際操作過程中 OUR和 CER對(duì)于尾氣分析儀干燥劑(硅膠) 的頻繁更換非常敏感。另外，計(jì)量甲醇添加量的電子天平的零點(diǎn)漂移較大，每10 h “負(fù)漂移”在10-20 g左右。由于低細(xì)胞密度誘導(dǎo)條件下，甲醇添加速度較慢，monellin能持續(xù)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，根據(jù)公式11、13和15，該“負(fù)漂移”實(shí)際上間接加大了η計(jì)算公式的分子且貢獻(xiàn)較大，導(dǎo)致η>1數(shù)據(jù)的頻繁出現(xiàn)。相反，在高細(xì)胞密度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，甲醇添加速度相對(duì)快。這時(shí)，零點(diǎn)漂移雖然也加大了η計(jì)算公式的分子，但貢獻(xiàn)率相對(duì)較低。同時(shí)，該條件下，能量利用效率參數(shù)η也確實(shí)低，所以在觀察窗口內(nèi)η>1的數(shù)據(jù)一個(gè)都沒有出現(xiàn)。總之，大多數(shù)η>1的數(shù)據(jù)均處于1.00-1.25，稍高于1的區(qū)域內(nèi)?？紤]到大多數(shù)發(fā)酵過程中嚴(yán)重的測(cè)量噪聲，因此，上述數(shù)據(jù)還是可以接受的。雖然批次#3中有許多η的數(shù)據(jù)大于1，但是批次#1中所有η的數(shù)據(jù)均未超過0.8。這些數(shù)據(jù)至少可以解釋這兩個(gè)極端批次 (#1和#3) 中NADH利用效率與monellin濃度的關(guān)聯(lián)性。

最后，必須承認(rèn)目標(biāo)蛋白(monellin)對(duì)甲醇的得率YP/S低下，僅有0.11%-0.75% (表1)。其中，批次#3的得率最高，達(dá)到0.75%。這與許多文獻(xiàn)中目標(biāo)蛋白/抗體對(duì)甲醇的得率低是相一致的(0.020%-0.093%)[12,23-26]。目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量與甲醇消耗量比例 (得率) 很低，但并不意味著走向目標(biāo)蛋白合成前體途徑的碳代謝比例也如此低。因?yàn)榭紤]到不正確的蛋白折疊/糖基化修飾等因素，大部分合成前體并不能有效地轉(zhuǎn)化成目標(biāo)蛋白。

3 結(jié)論

畢赤酵母表達(dá)monellin過程中，在低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，并將誘導(dǎo)溫度控制在30 ℃的發(fā)酵策略最優(yōu)，monellin濃度最高。我們分析了此誘導(dǎo)策略與其他誘導(dǎo)策略下的甲醇/能量代謝模式。結(jié)果表明，采用該最優(yōu)策略時(shí)，用于monellin前體物質(zhì)合成和NADH合成的碳流充足；用于支撐monellin合成的能量 (NADH) 利用效率最高；monellin合成與細(xì)胞生長(zhǎng)完全耦聯(lián)，耦聯(lián)系數(shù)α最大且細(xì)胞生長(zhǎng)速率較高，monellin合成速率最大。該誘導(dǎo)策略還可以緩解熱交換壓力和供氧負(fù)擔(dān)，有利于降低發(fā)酵成本。

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