基于植物rbcL基因測序?qū)Σ枞~進(jìn)行摻雜檢驗

王旻璇，張永杰

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

茶葉是我國具有傳統(tǒng)優(yōu)勢的特色農(nóng)產(chǎn)品，由茶樹Camellia sinensis葉片經(jīng)多種工藝加工而成，分成綠、黃、白、青、黑、紅六大基本茶類[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中含有黃酮類、酚酸類、非蛋白氨基酸、生物堿、聚胺類等多種生物活性物質(zhì)，對控制體重、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病等多種病癥表現(xiàn)出有益的作用[2]。作為中華民族的傳統(tǒng)飲品，茶葉的質(zhì)量和安全直接影響人體健康，事關(guān)整個產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和國家聲譽(yù)。隨著茶葉需求量的不斷增大，茶葉消費(fèi)市場以次充好、假冒偽劣甚至摻雜摻假現(xiàn)象時有發(fā)生[3-4]，給正常的茶葉消費(fèi)和進(jìn)出口貿(mào)易造成不良的影響。茶葉摻假摻雜的常見方式有：用已陳化或發(fā)霉變質(zhì)的茶葉冒充好的茶葉；用形態(tài)氣味與茶葉相近的其他樹葉冒充茶葉；用假茶、次茶摻入真茶當(dāng)中；甚至重新曬干已經(jīng)飲用過的茶葉來進(jìn)行多次銷售等[5]。此外，還有報道在茶葉中摻入淀粉、沙土、木灰、煤屑等[6]。在歐盟發(fā)布的有關(guān)“食品安全與食品摻假”的調(diào)查報告中，茶葉被列為歐盟市場易被摻假食品名單之一[7]。

傳統(tǒng)的茶葉摻雜摻假鑒別檢驗的方式主要是感官檢驗和理化檢驗[5,8]。這些傳統(tǒng)鑒別方式主要憑借業(yè)內(nèi)人士的經(jīng)驗積累，普通消費(fèi)者難以做到，并且難以準(zhǔn)確鑒定出摻雜的植物種類。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)逐漸滲透到各個生物領(lǐng)域，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain reaction，PCR) 技術(shù)具有快速、靈敏、特異性高的特點，已廣泛應(yīng)用于植物性食品和藥材中植物成分的檢測[9-12]，但在茶葉真?zhèn)舞b別領(lǐng)域的應(yīng)用還較少。

通過PCR技術(shù)擴(kuò)增一至數(shù)個DNA片段，可以進(jìn)行物種識別，并可避免在傳統(tǒng)鑒別方法中人為因素所造成的主觀錯判，從而有效地提高鑒別的準(zhǔn)確性和效率。要對物種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，必須選擇合適的DNA片段。2009年，生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦將編碼葉綠體核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基 (Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase large subunit，rbcL) 和成熟酶 K (Maturase K，matK) 的基因作為陸生植物的DNA條形碼序列[15]。本研究報道一種基于植物葉綠體rbcL基因片段進(jìn)行茶葉摻雜檢測的方法，該方法能夠定性判斷茶葉中是否摻雜及所摻雜的具體植物成分，使茶葉的摻雜檢測更加科學(xué)可靠。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究共選用了7份茶葉樣品 (表1)，涉及六大茶類。

表1 本研究使用的茶葉樣品信息Table 1 Tea samples used in this study

1.2 茶葉總DNA的提取和rbcL基因片段的擴(kuò)增

分別稱取每種茶葉樣品 0.13 g于 1.5 mL Eppendorf管中，用手持式G50研磨器 (卡尤迪生物科技有限公司) 研磨茶葉，并用CTAB (十六烷基三甲基溴化銨) 法提取總DNA[16]。從提取的茶葉總DNA中使用KOD-Plus DNA聚合酶 (東洋紡(上海) 生物科技有限公司) 在 T100 PCR 儀(美國BIO-RAD公司) 上擴(kuò)增rbcL基因片段，共需進(jìn)行兩輪 PCR。第一輪 PCR使用引物組合 rbcLa_F[17]和724R[18]，擴(kuò)增產(chǎn)物約750 bp；第二輪PCR使用引物組合rbcLa_F和rbcLa_R[19]，擴(kuò)增產(chǎn)物約600 bp。引物序列信息見表 2。第一輪擴(kuò)增以提取的茶葉總DNA為模板；第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍的稀釋液為模板。兩輪PCR各進(jìn)行40個循環(huán)，退火溫度分別為54 ℃和52 ℃。將第二輪擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物全部用于瓊脂糖凝膠電泳，使用 Gel Extraction kit (OMEGA公司) 進(jìn)行切膠回收。

表2 本研究使用的引物信息Table 2 Primers used in this study

1.3 rbcL基因片段的克隆與測序

取 4 μL切膠純化的 DNA 片段與 1 μL pEASY-Blunt3克隆載體 (全式金生物技術(shù)有限公司) 混合后16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，隨機(jī)挑選約10個陽性克隆用載體引物M13F或PCR引物rbcLa_F測序。同時，將切膠純化的PCR產(chǎn)物用rbcLa-F進(jìn)行直接測序。

1.4 測序結(jié)果的分析

通過 FinchTV軟件 (http://downloads.informer.com /finchtv/) 觀察PCR產(chǎn)物直接測序所得的測序峰圖中是否有雜峰，據(jù)此可粗略判斷樣品的純度。精確判斷時，首先除去克隆測序所得序列中的載體序列，然后對留下的rbcL序列在GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 和/或 BOLD (http://www.barcodinglife.org/index.php/IDS_OpenIdEngine) 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast (基于局部比對算法的搜索分析)搜索，確定rbcL序列所代表的植物種類。利用MEGA 6.06軟件[20]對克隆獲得的rbcL序列進(jìn)行多重比對，切齊兩端序列后用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 rbcL基因片段擴(kuò)增結(jié)果

通過兩輪PCR擴(kuò)增，從7份茶葉樣品中都得到了明亮的rbcL擴(kuò)增條帶 (圖1)，可用于本研究的測序和克隆分析。

圖1 7份茶葉樣品rbcL擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖Fig.1 Electrophoretic patterns of rbcL amplicons from seven tea samples.Please refer to Table 1 for codes of these tea samples.Mr indicates Trans2K Plus DNA Ladder.

2.2 信陽毛尖的檢驗結(jié)果

信陽毛尖 (M) 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的峰圖中無套峰，即測序圖譜上每個位點只識別出一種堿基(圖2)。將該擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑選10個陽性克隆 (M1-M10) 進(jìn)行測序，所得序列經(jīng) Blast分析全部為茶樹C.sinensis的序列。

圖2 rbcL擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序顯示無套峰的圖譜示例Fig.2 A representative chromatogram of direct sequencing of rbcL amplicons without heterozygous peaks.

2.3 岳陽黃茶的檢驗結(jié)果

岳陽黃茶 (H) 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的峰圖同信陽毛尖一樣，沒有顯示套峰位點。挑選8個陽性克隆 (H1–H5，H7–H9) 進(jìn)行測序，所得序列全部為茶樹C.sinensis。

2.4 太姥銀針的檢驗結(jié)果

太姥銀針 (L) 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的峰圖顯示部分位置有套峰 (圖3)。對10個陽性克隆進(jìn)行測序的結(jié)果顯示，3個克隆 (L4、L7和L10) 為茶樹C.sinensis的序列，2個克隆 (L1和L3) 為茶屬(Camelliaspp.) 植物的序列 (其與茶樹C.sinensis的序列相似性最高約98%，無法確切判斷是否為茶樹)，1個克隆 (L8) 為芭蕉屬 (Musaspp.) 植物的序列，1個克隆 (L2) 為傘形花科(Apiaceae) 植物的序列，1個克隆 (L9) 為莢蒾屬(Viburnumspp.) 植物的序列 (與公共數(shù)據(jù)庫中的rbcL序列相似性最高約 96%)，1個克隆 (L5) 可能為金虎尾科(Malpighiaceae) 植物的序列 (與公共數(shù)據(jù)庫中的rbcL序列相似性最高約95.5%)，1個克隆 (L6) 為被子植物門 (Magnoliophyta) 植物的序列 (與公共數(shù)據(jù)庫中的rbcL序列相似性最高只有94%)。

圖3 rbcL擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序顯示有套峰的圖譜示例Fig.3 A representative chromatogram of direct sequencing of rbcL amplicons with heterozygous peaks.

2.5 鐵觀音的檢驗結(jié)果

鐵觀音 (T) 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的峰圖顯示部分位置有套峰 (類似圖3)。對10個陽性克隆進(jìn)行測序的結(jié)果顯示，7個克隆 (T2–T6、T8和T9)為茶樹C.sinensis的序列，1個克隆 (T7) 為芭蕉屬(Musaspp.) 植物的序列，1個克隆 (T10) 為葫蘆科的黃瓜Cucumis sativus，1個克隆 (T1)為雙子葉植物綱 (Magnoliopsida) 某植物的序列 (與公共數(shù)據(jù)庫中rbcL序列的相似性最高只有97%，無法確認(rèn)到更低級的分類單元)。

2.6 正山小種的檢驗結(jié)果

正山小種 (Z) 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的峰圖顯示部分位置有雜峰 (類似圖3)。對9個陽性克隆進(jìn)行測序的結(jié)果顯示，3個克隆 (Z5、Z7和 Z8)為茶樹C.sinensis的序列，2個克隆 (Z1和Z3)為楊柳科柳屬 (Salixspp.) 植物的序列，2個克隆(Z4和Z10) 為傘形花科 (Apiaceae) 植物的序列，1個克隆 (Z2) 為葫蘆科的黃瓜 (C.sativus)，1個克隆 (Z6) 為蕓香科 (Rutaceae) 植物的序列。

2.7 六堡茶的檢驗結(jié)果

六堡茶 (B) 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的峰圖顯示部分位置有套峰 (類似圖3)。對10個陽性克隆進(jìn)行測序的結(jié)果顯示，2個克隆 (B3和B4) 為茶樹C.sinensis的序列，2個克隆 (B7和B9) 為傘形花科 (Apiaceae) 植物的序列，2個克隆 (B2和B8) 為豆科 (Fabaceae) 植物的序列，2個克隆(B1和 B5) 為葫蘆科 (Cucurbitaceae) 植物的序列，2個克隆 (B6和 B10) 為雙子葉植物綱(Magnoliopsida) 某植物的序列 (與公共數(shù)據(jù)庫中的rbcL序列相似性最高只有96.5%)。

2.8 宮廷普洱的檢驗結(jié)果

宮廷普洱 (P) 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的峰圖顯示部分位置有套峰 (類似圖3)。對10個陽性克隆進(jìn)行測序的結(jié)果顯示，3個克隆 (P6，P8和B10)為茶樹C.sinensis的序列，2個克隆 (P1和P7) 為胡麻科芝麻Sesamum indicum的序列，2個克隆(P2和P3) 為唇形目 (Lamiales) 植物的序列，1個克隆 (P4) 為傘形花科 (Apiaceae) 植物的序列，1個克隆 (P5) 為薔薇科 (Rosaceae) 植物的序列，1個克隆 (P9) 為芭蕉科芭蕉屬 (Musaspp.)植物的序列。

2.9 不同茶葉樣品摻雜植物成分的比較

圖4 利用克隆檢測到的rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed using rbcL sequences generated from clone sequencing.Please note that when searching online reference databases, some rbcL sequences can only be identified to above-species level taxonomy.

利用克隆測序所得的全部rbcL序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖 4)。從中可知，一些植物成分僅在特定的茶葉中檢測到，如唇形目芝麻僅發(fā)現(xiàn)于普洱茶中，柳屬植物僅發(fā)現(xiàn)于正山小種中；另一些植物成分可在不同的茶葉中同時檢測到，如在正山小種和鐵觀音中都檢測到黃瓜，在鐵觀音、普洱茶和太姥銀針中都檢測到某芭蕉屬植物。

3 結(jié)論與討論

對于茶葉中摻雜植物成分的檢測，傳統(tǒng)的方法是通過宏觀和微觀形態(tài)來識別其中的植物成分，然而有些茶葉經(jīng)包裝或粉碎后，很難辨認(rèn)其中的植物成分。利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測，不受植物形態(tài)和加工過程的影響，可用于食物原材料的鑒定、溯源和摻偽檢測等[9-14]，但在茶葉摻雜摻假檢測方面的應(yīng)用還比較少。本研究建立了基于植物rbcL基因序列定性檢測茶葉中是否摻雜其他植物成分的方法。使用該方法時，直接觀察rbcL的測序峰圖，就可基本確定某茶葉樣品是否摻雜；對rbcL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序和序列分析，可進(jìn)一步確定摻雜的具體植物種類。理論上講，另一個植物DNA條形碼片段matK也應(yīng)可用于本研究，但我們前期發(fā)現(xiàn)從茶葉樣品中擴(kuò)增matK的成功率不如rbcL高[21]，因此我們選用了rbcL進(jìn)行研究。

利用所建立的方法對 7份茶葉樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)正山小種、鐵觀音、太姥銀針、六堡茶、宮廷普洱都不同程度地混雜有其他植物成分。從這 5種茶葉中，共檢測到近 20種污染植物成分(圖4)。我們之前從部分普洱熟茶樣品中檢測到芭蕉屬、松屬Pinus和蕓薹屬Brassica的植物成分[21]。本研究檢測到了芭蕉屬的植物，但沒有檢測到松屬和蕓薹屬的植物。普洱茶和六堡茶作為后發(fā)酵茶，在加工過程中有“渥堆發(fā)酵”的過程[22]；渥堆發(fā)酵中用到的覆蓋物和翻堆工具等都可能帶進(jìn)污染。其他茶葉中是如何摻雜進(jìn)其他植物成分的，以及為什么要進(jìn)行摻雜尚不清楚。盡管本研究從茶葉中檢測到多種植物成分，但其中并沒有已知的明顯產(chǎn)毒性物質(zhì)的植物成分。

本研究的主要目的是建立檢測茶葉中是否摻雜其他植物成分的方法，因此每一茶類只選取了1–2份代表性的茶葉樣品。各類茶葉中摻雜植物成分的整體狀況如何，有待今后通過對大量樣品的檢測分析才能知曉?？梢灶A(yù)見，通過分析大量的茶葉樣品后，還會從茶葉中檢測出更多的植物成分。例如，本研究并沒有檢測到文獻(xiàn)中所報道的楊樹、小麥、玉米、大豆等植物成分[3,23]。

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