IL-17D調(diào)控肺臟NK細(xì)胞募集及黃芪的促進(jìn)作用①

蘭紅云 鄭曉丹 郭鈺琪 安 磊 孫曉艷 呂衍民 王 麗 姚成芳

(濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250200)

肺臟是氣體交換的主要部位，時(shí)刻受到外源性病原微生物、過敏原及微粒狀污染物的威脅，是各種病原體入侵的主要門戶，因此，需要有效的免疫防御機(jī)制來保護(hù)其免受有害物質(zhì)的損傷，維持正常功能。肺組織自身的黏膜免疫屏障功能既可抵抗外界病原體的入侵，又可促進(jìn)其降解[1]，天然免疫系統(tǒng)在這一過程中起主導(dǎo)作用,其中，NK細(xì)胞因其強(qiáng)大的抗腫瘤、抗病毒效應(yīng)在維持肺臟免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演了重要角色[2]。

NK細(xì)胞是機(jī)體抗感染的第一道防線，受組織局部CXCL9、CXCL10等不同趨化因子的調(diào)控，在不同組織器官分布狀態(tài)不同[3,4]。肺臟是NK細(xì)胞大量分布的重要器官之一，肺臟NK細(xì)胞通過快速、大量分泌IFN-γ、穿孔素和顆粒酶等效應(yīng)因子，在免疫監(jiān)視和免疫清除過程中發(fā)揮重要作用[5]。因此，NK細(xì)胞在肺臟局域免疫中起著關(guān)鍵作用。肺臟局部NK細(xì)胞的趨化和募集能力是體現(xiàn)肺臟抗腫瘤免疫的重要保障，但肺臟局部調(diào)控NK細(xì)胞募集的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)尚待明確。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-17家族對細(xì)胞的遷移和趨化有很強(qiáng)的調(diào)控作用：IL-17 家族成員可通過調(diào)控多種趨化因子招募嗜中性粒細(xì)胞和其他先天免疫細(xì)胞局部募集[6]。IL-17D屬于IL-17家族，與腫瘤的侵襲密切相關(guān)[7]。但是IL-17D對肺臟NK細(xì)胞的募集有怎樣的調(diào)控作用尚無人報(bào)道。本研究旨在探討IL-17D調(diào)控肺臟NK細(xì)胞募集的分子機(jī)制及黃芪的作用。

黃芪(Astragalus membranaceus，AG)是經(jīng)典的補(bǔ)益肺氣中藥[8]，味甘性溫，歸肺脾二經(jīng)，通過益氣固表、養(yǎng)心通脈等功效，保護(hù)肺氣的充實(shí)和穩(wěn)定[9]。但黃芪調(diào)控肺臟NK細(xì)胞的募集及其藥理機(jī)制尚無報(bào)道。我們研究發(fā)現(xiàn)，黃芪補(bǔ)益肺氣的關(guān)鍵作用機(jī)理之一是上調(diào)肺臟IL-17D的表達(dá)和NK細(xì)胞含量，促進(jìn)肺臟抗腫瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)采用SPF級雌性C57BL/6小鼠，周齡6～7周，體重(18.29±1.41)g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心。飼養(yǎng)于室溫 22～26℃，相對濕度45%～55%的IVC動(dòng)物層流柜。

1.1.2藥物 中藥黃芪購自山東省人民藥業(yè)有限公司(批號160909)，經(jīng)該公司鑒定為豆科植物黃芪的干燥根部切片。稱取適量的黃芪生品，常規(guī)法水煎、醇沉、回收乙醇，制成含黃芪生藥0.0625 g/ml原液，滅菌后儲(chǔ)存于4℃冰箱，用于小鼠常規(guī)飲用給藥。

1.1.3主要試劑與儀器 RNA提取所用試劑：總RNA提取試劑Trizol Reagent(LOT03877/10125)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DEPC水(LJ0113B2011T)購自AMRESCO公司。無水乙醇、異丙醇、氯仿等試劑購自天津市鑫達(dá)醫(yī)藥化工試劑有限公司。Reverse Transcription PCR(RT-PCR)所用試劑：M-MLV購于Fermentas公司；Oligo dT購于Thermo Scientific公司；RNA酶抑制劑、dNTP、2×Taq Master DNA聚合酶等試劑均購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、CXCL-9、IL-15等引物(見表1)均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)、離子霉素(Ionomycin)和蛋白轉(zhuǎn)錄抑制劑(BFA)均購自Sigma 公司。PE-Cy5-CD3、PE-NK1.1、PE-IL-17D等大鼠抗小鼠抗體均購自美國BD公司。FACS verse流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

表1引物序列

Tab.1Primersequence

GeneUpstream(5′?3′)Downstream(5′?3′)GAPDHACCACAGTCCATGCCATCACTCCACCACCCTGTTGCTGTAIL?15CATCCATCTCGTGCTACTTGTGGCCTCTGTTTTAGGGAGACCTCXCL?9CGGACTTCACTCCAACACAGTAGGGTTCCTCGAACTCCACIL?17DGGGCGTACAGGATTTCCTACAGAGAAGACGGGTGTGCTG

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為4組，即正常對照組、B16模型組、B16模型+IL-17D滴鼻實(shí)驗(yàn)組、B16模型+黃芪組，每組6只。正常對照組自由飲水?dāng)z食。B16肺癌模型給予B16細(xì)胞2×105個(gè)/300 μl/只尾靜脈注射。1周后，B16注射+IL-17D滴鼻實(shí)驗(yàn)組給予IL-17D制劑40 μl/只滴鼻，連續(xù)一周，B16模型+黃芪組給予黃芪制劑常規(guī)飲用至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，劑量為0.062 5 g/(kg·d)。

1.2.2胞內(nèi)外染色法檢測IL-17D、NK細(xì)胞含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，無菌沖洗并分離小鼠肺臟，經(jīng)研磨過濾制成肺組織單細(xì)胞懸液，RPMI1640重懸細(xì)胞并調(diào)整濃度至5×106個(gè)/ml，接種于24孔板，根據(jù)經(jīng)典方法檢測IL-17D、NK細(xì)胞含量[10]。主要步驟：PMA等刺激培養(yǎng)5 h后，收集細(xì)胞，1×PBS洗滌，封閉Fc受體，加入適量熒光抗體(PE-Cy5-CD3、PE-NK1.1)，4℃避光孵育30 min，洗滌后，采用BD固定穿膜試劑盒穿膜固定，加入適量PE-IL-17D抗體，4℃避光孵育1 h，經(jīng)穿膜緩沖液及PBS洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測并分析NK細(xì)胞(CD3-NK1.1+)及IL-17D(IL-17D+)的比例和數(shù)量。

1.2.3RT-PCR法檢測各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平 根據(jù)TRIZOL201法提取肺組織總RNA；經(jīng)ND-1000分光光度儀檢測RNA的純度與含量，調(diào)整RNA濃度進(jìn)行RT反應(yīng)；采用25 μl總反應(yīng)體系經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸等過程完成PCR反應(yīng)；PCR擴(kuò)增結(jié)束后采用1.5%瓊脂糖凝膠(EB染色)水平電泳；使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)顯影：以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因片段相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1肺臟腫瘤誘導(dǎo)局部IL-17D及其NK細(xì)胞含量顯著下降 在小鼠B16肺癌轉(zhuǎn)移模型中，RT-PCR和流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示肺臟局部IL-17D基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平較野生型小鼠顯著降低(P<0.01)，結(jié)果見圖1A～C。同時(shí)，小鼠肺腫瘤組織中NK細(xì)胞比例較正常對照小鼠明顯減少(P<0.01)，見圖2A、B。

2.2IL-17D上調(diào)肺腫瘤組織NK細(xì)胞含量抑制腫瘤克隆形成 在小鼠肺癌模型中我們觀察到IL-17D表達(dá)水平與NK細(xì)胞含量降低發(fā)生同步改變，為進(jìn)一步證明腫瘤組織中IL-17D表達(dá)變化與NK細(xì)胞含量降低的直接關(guān)系，本研究采用IL-17D經(jīng)鼻回補(bǔ)方法，在小鼠肺癌模型中，進(jìn)一步觀察IL-17D對肺臟NK細(xì)胞含量的影響及其腫瘤克隆的形成狀態(tài)。結(jié)果顯示：B16模型小鼠經(jīng)IL-17D制劑滴鼻處理后，肺腫瘤克隆數(shù)較B16模型組明顯減少(P<0.01),見圖3A、B，同時(shí)，肺臟NK細(xì)胞含量顯著升高(P<0.01)，見圖3C。由此我們推斷，IL-17D是影響肺臟局部NK細(xì)胞含量的重要細(xì)胞因子，是肺臟NK細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用的重要分子基礎(chǔ)。

圖1 B16肺轉(zhuǎn)移模型中IL-17D表達(dá)下降 Fig.1 Reduction of IL-17D in lung with B16 melano-ma metastasisNote: **.P<0.01

2.3IL-17D上調(diào)肺臟CXCL9和IL-15表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，IL-17D處理后，可顯著提高肺癌組織中CXCL9、IL-15等NK細(xì)胞募集功能相關(guān)因子的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖4。

2.4黃芪上調(diào)肺臟IL-17D表達(dá)和NK細(xì)胞含量和抑制腫瘤肺臟轉(zhuǎn)移 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，黃芪給藥處理后，實(shí)驗(yàn)組小鼠較腫瘤模型對照組小鼠肺組織中的IL-17D及NK細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，圖5A、B，肺臟B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶的形成受到明顯抑制(P<0.01),見圖5C、D。

圖2 B16肺轉(zhuǎn)移模型中肺臟NK細(xì)胞含量顯著下降Fig.2 Decreased lung resident NK cells in lung with B16 melanoma metastasisNote: **.P<0.01.

圖3 IL-17D可增加肺臟NK細(xì)胞含量減少B16肺轉(zhuǎn)移克隆形成Fig.3 Up-regulation of lung resident NK cells and reduction of lung tumor foci after IL-17D nasal-treatment in B16 melanoma metasta-sis modelNote: **.P<0.01.

圖4 IL-17D上調(diào)肺臟CXCL9和IL-15的表達(dá)Fig.4 IL-17D promotes CXCL9 and IL-15 production in lung

圖5 中藥黃芪對肺臟IL-17D、NK細(xì)胞和B16肺轉(zhuǎn)移克隆形成的影響Fig.5 Effects of Astragalus (AG) on lung IL-17D production,proportion of NK cells and lung tumor fociNote: *.P<0.05，**.P<0.01.

3 討論

NK細(xì)胞具有免疫清除和免疫監(jiān)視的功能，可快速殺傷病毒感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一。NK細(xì)胞通過分泌IFN-γ、穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞因子發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，并通過分泌多種細(xì)胞因子啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)，發(fā)揮多種抗感染免疫協(xié)同作用。NK細(xì)胞在體內(nèi)不同組織器官分布狀態(tài)不同，多依據(jù)局部組織中細(xì)胞因子或趨化因子微環(huán)境不同而不同。肺臟因常常應(yīng)對外界危險(xiǎn)物質(zhì)的威脅,包括病原微生物、毒素、過敏原和塵埃的反復(fù)刺激，同時(shí)，又面臨突變細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等各種危險(xiǎn)，因此，需要大量的NK細(xì)胞發(fā)揮其抗炎抗腫瘤作用，主導(dǎo)或參與維持局部微環(huán)境的穩(wěn)定，這也使肺臟成為了NK細(xì)胞大量聚集的重要器官之一。NK細(xì)胞在肺臟免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用，也成為肺臟拮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的主力細(xì)胞群體。肺臟局部駐留NK細(xì)胞的多少，直接決定肺臟免疫微環(huán)境的穩(wěn)定，特別是影響肺臟抗腫瘤形成的能力。肺臟局部NK細(xì)胞表型不同且功能各異[11]。具有抗腫瘤效應(yīng)的肺臟NK細(xì)胞高表達(dá)CXCR3，可與組織局部CXCL9、CXCL10、CXCL11等趨化因子相互作用，控制NK細(xì)胞肺臟駐留。同時(shí)，微環(huán)境中IL-15等細(xì)胞因子可維持NK細(xì)胞在局部募集并生存。這些細(xì)胞因子和趨化因子成為肺臟對NK細(xì)胞募集能力的重要標(biāo)志，是肺臟NK細(xì)胞駐留的重要分子基礎(chǔ)，針對這些細(xì)胞因子，尋找調(diào)控他們并且與他們發(fā)生同步變化的細(xì)胞因子，可以獲得調(diào)控NK細(xì)胞肺臟募集能力的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)，同時(shí)也將為改善并促進(jìn)肺臟NK細(xì)胞抗炎抗腫瘤能力提供新的重要策略。

IL-17家族作為黏膜組織最敏感的感受器，其家族成員能趨化多種免疫細(xì)胞至炎癥灶或癌巢發(fā)揮抗炎、抗腫瘤效應(yīng)，IL-17家族作為多種細(xì)胞趨化的關(guān)鍵，其中多個(gè)家族成員的功能目前已被廣泛研究。但是關(guān)于IL-17D的功能調(diào)控，目前研究較少。已知IL-17D在肺臟和骨骼肌高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞自身分泌的IL-17D可刺激腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞招募NK細(xì)胞到腫瘤組織，并促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞的發(fā)育和抗腫瘤的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[12]，但肺臟IL-17D對局部NK細(xì)胞募集能力的影響尚未見報(bào)道。

我們研究發(fā)現(xiàn)，肺臟局部IL-17D表達(dá)水平與肺臟NK細(xì)胞含量密切相關(guān)。在小鼠B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，IL-17D表達(dá)驟降，并且NK細(xì)胞含量顯著降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在肺腫瘤中缺失的NK細(xì)胞，通過IL-17D經(jīng)鼻回補(bǔ)處理又回歸肺臟，并顯著抑制了肺轉(zhuǎn)移腫瘤克隆的形成，這一結(jié)果證明了IL-17D可以調(diào)控NK細(xì)胞在肺臟的募集。同時(shí)，黃芪上調(diào)肺臟IL-17D表達(dá)和NK細(xì)胞含量這一實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)論。

通過實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步證明了IL-17D可明顯上調(diào)CXCL9和IL-15表達(dá)，從而為NK細(xì)胞的肺臟募集創(chuàng)造了適宜的細(xì)胞因子微環(huán)境，從而使肺臟擁有足夠的NK細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。IL-17D通過調(diào)控什么信號來左右趨化因子的表達(dá)從而影響NK細(xì)胞的募集和駐留，這一問題尚需進(jìn)一步研究。

中醫(yī)中藥作為我國傳統(tǒng)智慧的結(jié)晶，成為抗腫瘤治療的關(guān)注焦點(diǎn)。近年來，許多學(xué)者在中醫(yī)藥與腫瘤免疫方面進(jìn)行了廣泛而深入的研究，許多中藥材可通過增強(qiáng)或恢復(fù)癌癥患者免疫功能以達(dá)到抗腫瘤的目的。大量研究已證實(shí)：黃芪作為一味補(bǔ)益良藥具有補(bǔ)肺健脾、益腎脫毒之功效。研究表明黃芪及其有效成分可通過多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，同時(shí)具有抗病毒感染、抗腫瘤等作用[13,14]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪中含量最多的有效成分黃芪多糖能促T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、刺激 NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性反應(yīng)[15]，同時(shí)還有抗衰老輻射、抗氧化應(yīng)激等作用[16]。研究表明黃芪單獨(dú)應(yīng)用具有一定的抗腫瘤作用，當(dāng)與化療藥聯(lián)合用藥時(shí)具有增效解毒之益處[17]。

我們研究發(fā)現(xiàn)中藥黃芪補(bǔ)益肺氣的免疫藥理基礎(chǔ)之一就是提高肺臟局部組織IL-17D的表達(dá)，從而提高肺臟NK細(xì)胞的募集能力，進(jìn)而抑制腫瘤的形成，從分子和細(xì)胞以及整體動(dòng)物層面，明確了黃芪補(bǔ)益肺氣的組織特異性藥理藥效的免疫學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)也佐證了黃芪補(bǔ)肺氣的關(guān)鍵之一是上調(diào)IL-17D的表達(dá)，從而改變肺臟NK細(xì)胞的募集，發(fā)揮抗腫瘤作用。由此，圍繞IL-17D和NK細(xì)胞，我們明確了黃芪補(bǔ)益肺氣的部分免疫藥理學(xué)作用機(jī)制，拓展了傳統(tǒng)中藥黃芪的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤藥用價(jià)值，再次確認(rèn)了IL-17D在肺臟NK細(xì)胞募集效應(yīng)中的主導(dǎo)地位，也為腫瘤的中藥免疫治療提供了新的思路。

[1] Brandtzaeg P,Pabst R.Let′s go mucosal:communication on slippery ground [J].Trends Immunol,2004,25(11):570-577.

[2] 陳力川,汪思亮,余蘇云,等.NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展[J].腫瘤,2017,37(1):101-106.

Chen LC,Wang SL,Yu SY,etal.Progress in natural killer cells for tumor immunotherapy[J].Tumor,2017,37(1):101-106.

[3] Gregoire C,Chasson L,Luci C,etal.The trafficking of natural killer cells[J].Immunol Rev，2007，220:169-182.

[4] Thapa M,Kuziel WA,Carr DJ.Susceptibility of CCR5-deficient mice to genital herpes simplex virus type 2 is linked to NK cell mobilization [J].J Virol，2007,81(8):3704-3713.

[5] Wang J,Li F,Zheng M,etal.Lung natural killer cells in mice:phenotype and response to respiratory infection[J].Immunology, 2012，137:37-47.

[6] Pappu R,Ramirez-Carrozzi V,Sambandam A.The interleukin-17 cytokine family:critical players in host defence and inflammatory diseases[J].Immunology,2011，134(1):8-16.

[7] Statues T，Broxmeyer HE，Robertson MJ,etal.Cutting edge：IL-17 D.a novel member of the IL-17 family.stimulates cytokine production and inhibits hemopoiesis [J].J Immunol，2002,169(2):642-646.

[8] 李淑芳.中藥黃芪藥理作用研究進(jìn)展[J].湖北中醫(yī)雜志,2013,35(6):73-75.

Li SF.Research progress on pharmacological action of astragalus[J].Hubei J Traditional Chin Med,2013,35(6):73-75.

[9] 顏 婕,周思敏,田懷軍,等.黃芪對缺氧小鼠抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用的效果研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(15):2809-2812.

Yan J,Zhou SM,Tian HJ,etal.Study of astragalus on the anti-fatigue effect in hypoxic mice[J].Progress Modern Biomed,2013,13(15):2809-2812.

[10] 鄭曉丹,郭鈺琪,張洪海,等.輻射損傷后T細(xì)胞亞群的免疫重建特點(diǎn)及中藥山茱萸的調(diào)節(jié)作用[J].中國免疫學(xué)雜志,2015,31(6):769-773.

Zheng XD,Guo YQ,Zhang HH,etal.The characteristic of immunological reconstitution of T cell subsets after irradiation and the immunoregulatory activity of Chinese medicinal herb cornus[J].Chin J Immunol,2015,31(6):769-773.

[11] Wang J,Li F,Zheng M,etal.Lung natural killer cells in mice:phenotype and response to respiratory infection [J].Immunology,2012,137(1):37-47.

[12] O′Sullivan T,Saddawikonefka R,Gross E,etal.Interleukin-17D mediates tumor rejection through recruitment of natural killer cells [J].Cell Rep,2014,7(4):989.

[13] 張 薔,高文遠(yuǎn),滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2012,37(21):3203-3207.

Zhang Q,Gao WY,Man SL.Chemical composition and pharmacological activities of Astragali Radix[J].China J Chin Materia Med,2012,37(21):3203-3207.

[14] 朱燕輝,嚴(yán)奉祥.黃芪甲苷及其生物學(xué)活性[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(4):781-783.

Zhu YH，Yan FX.Astragaloside IV and Its Biological Activity[J].Progress Modern Biomed,2008,8(4):781-783.

[15] 王永海,邢建群,寇麗春,等.黃芪多糖對非小細(xì)胞肺癌放療患者免疫功能的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)2015,31 (3):554-555.

Wang YH，Xing JQ，Kou LH,etal.Effects of astragalus polysaccharides on immune function of patients with radiotherapy for non-small cell lung cancer[J].J Changchun University Traditional Chin Med,2015,31(3):554-555.

[16] 左 軍,張文釗,胡曉陽,等.黃芪現(xiàn)代藥理及臨床研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(1):111-112.

Zuo J,Zhang WZ,Hu XY,etal.Modern pharmacology and clinical research progress of astragalus[J].Information on Traditional Chin Med,2014,31(1):111-112.

[17] Luo T,Qin J,Liu M,etal.Astragalus polysaccharide attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in microglial cells:regulation of protein kinase B and nuclear factor-κB signaling.[J].Inflammation Res,2015,64(3-4):205-212.