血漿miRNA-200b及miRNA-21在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義①

唐 梅 林麗慧 林 元 薛萬(wàn)興 蘇紅娥

(海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，那大 571799)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、病情進(jìn)展迅速、病死率高和5年生存率低等特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤[1]。目前，仍沒(méi)有特異性的生物學(xué)指標(biāo)可以用于卵巢癌的早期診斷、指導(dǎo)治療及預(yù)后評(píng)估。近期的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，其中miRNA-21和miRNA-200b與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可能在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮癌基因的作用[2，3]。本研究通過(guò)檢測(cè)血漿miRNA-200b及miRNA-21在上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)患者中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與EOC臨床病理特征間的關(guān)系，旨在為EOC的早期診斷及靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2012年1月至2016年12月海南西部中心醫(yī)院收治行手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者162例，年齡28～79歲，平均(54.27±11.83)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理確診為上皮性卵巢癌并適合手術(shù)治療者；②術(shù)前均未接受放射治療和化療者；③能配合本次研究及病歷資料完整者。另取同期與卵巢癌患者年齡匹配的上皮性卵巢良性腫瘤患者120例(58例良性漿液性囊腺瘤、32例黏液性囊腺瘤、21例泡膜細(xì)胞瘤、9例成熟型畸胎瘤)作為良性組和正常健康女性108例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均于清晨空腹抽靜脈血5 ml，離心分離血漿后保存于-80℃冰箱待檢。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。

1.2.2miRNA的提取 取300 μl血漿樣本，加入1 ml總miRNA提取液，按照血液總miRNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)說(shuō)明書從血漿中提取總RNA。

1.2.3miRNA逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR檢測(cè) 以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP)，1.00 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl)，4.16 μl無(wú)菌三蒸水。反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，反應(yīng)體系為20 μl：1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00 μl TaqMan?Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液，1.33 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μl DEPC水。擴(kuò)增條件為：95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃15 s、60℃ 60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算microRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.4血清CA125檢測(cè) 使用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒檢測(cè)血清CA125水平，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1EOC患者基本分布特征 162例EOC患者年齡≥50歲的占62.3%(101/162)；手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期23例，Ⅱ期35例，Ⅲ期84例，Ⅳ期20例；病理類型：漿液性癌116例，透明細(xì)胞癌20例，黏液性癌14例，子宮內(nèi)膜樣癌8例，混合型細(xì)胞癌3例；病理分級(jí)：高分化癌(G1)9例，中分化癌(G2)30例，低分化癌(G3)123例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移92例；術(shù)后有殘余腫瘤68例，無(wú)殘余腫瘤94例。

2.2各組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達(dá)水平比較 EOC組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達(dá)水平均明顯高于良性組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而良性組與對(duì)照組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3EOC患者血漿miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 隨著EOC臨床分期的進(jìn)展，miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)水平逐漸升高，Ⅲ～Ⅳ期EOC患者中兩者的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血漿miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CA125水平也相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理類型、病理分級(jí)及術(shù)后有殘余腫瘤無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125對(duì)EOC的診斷價(jià)值 血漿miRNA-200b、miRNA-21、CA125及三項(xiàng)聯(lián)合診斷EOC的曲線下面積(AUC)及95%CI分別為0.896(0.834～0.958)、0.792(0.731～0.847)、0.908(0.841～0.973)、0.947(0.883～0.995)，與對(duì)照組(AUC=0.5)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miRNA-200b、miRNA-21及CA125診斷EOC的最佳截值分別為2.08、1.46、52.84U/ml。三項(xiàng)聯(lián)合診斷EOC的敏感度和特異度較好，分別為97.2%和78.3%。見(jiàn)圖1和表3。

GroupsnmiRNA?200b(2-ΔΔCt)miRNA?21(2-ΔΔCt)CA125(U/ml)Controlgroup1081 15±0 341 04±0 2821 53±9 45Benigngroup1201 26±0 371 18±0 3226 27±11 36EOCgroup1623 52±1 031)2)2 32±0 451)2) 78 64±30 571)2)F15 1868 42910 619P<0 001<0 001<0 001

Note：Compared with the control group,1)P<0.01；compared with the benign group,2)P<0.01.

表2EOC患者血漿miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2RelationshipbetweenexpressionofplasmamiRNA-200bandmiRNA-21andclinicopathologicalfeaturesinpatientswithEOC

GroupsnmiRNA?200b(2-ΔΔCt)PmiRNA?21(2-ΔΔCt)PAge(year)0 5840 627<50613 46±0 952 27±0 42≥501013 63±1 122 42±0 63Menopause0 3630 416Yes1063 34±0 852 14±0 42No563 75±1 162 53±0 68Pathologicalstaging0 0270 034Ⅰ-Ⅱstage581 96±0 641 41±0 36Ⅲ-Ⅳstage1045 18±1 273 37±0 84Pathologicaltype0 6580 742Serouscarcinoma1163 68±1 072 50±0 48Clearcellcarcinoma203 56±1 032 42±0 46Mucinousadenocarcinoma143 42±0 932 28±0 43Endometrioidcarcinoma83 38±0 872 25±0 41Mixedcellcarcinoma33 64±1 052 53±0 56Pathologicalgrading0 5170 603G193 60±1 042 44±0 46G2303 44±0 922 25±0 39G31233 58±1 022 37±0 42Residualtumorsaftertheoperation0 1420 254Yes683 18±0 742 07±0 38No943 91±1 182 68±0 71Lymphnodemetastasis0 0060 013Yes706 28±1 314 16±1 05No921 36±0 421 47±0 38CA125(U/ml)0 0150 022<50341 92±0 601 37±0 34≥501285 26±1 283 46±0 85

圖1 血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125診斷EOC的ROC曲線Fig.1 ROC curve of plasma miRNA-200b,miRNA-21 and CA125 in diagnosis of EOC

2.5多元Logistic回歸模型分析血漿miRNA-200b及miRNA-21與EOC的關(guān)系 把EOC組與對(duì)照組作為二分變量，以miRNA-200b、miRNA-21及CA125作為自變量，應(yīng)用多元Logistic回歸模型對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125水平升高是EOC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[OR(95%CI)=2.518(1.563～3.547)，OR(95%CI)=1.724(1.103～2.528)，OR(95%CI)=2.316(1.347～3.419)]。見(jiàn)表4。

2.6EOC患者血漿miRNA-200b與miRNA-21、CA125的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，血漿miRNA-200b與miRNA-21呈正相關(guān)(r=0.516，P<0.01)；血漿miRNA-200b與CA125呈正相關(guān)(r=0.702，P<0.01)；血漿miRNA-21與CA125呈正相關(guān)(r=0.604，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

表3血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125對(duì)EOC的診斷價(jià)值

Tab.3DiagnosticvalueofplasmamiRNA-200b,miRNA-21andCA125inEOC

ItemOptimumcut?offStandarderrorAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)miRNA?200b2 080 0370 896(0 834-0 958)<0 00187 580 484 283 6miRNA?211 460 0520 792(0 731-0 847)<0 00184 270 573 881 5CA12552 84U/ml0 0350 908(0 841-0 973)<0 00191 674 878 088 6miRNA?200b+CA125-0 0310 916(0 852-0 981)<0 00194 276 379 590 8miRNA?21+CA125-0 0460 841(0 778-0 893)<0 00185 775 279 380 6Threeunions-0 0280 947(0 883-0 995)<0 00197 278 382 692 7

表4多元Logistic回歸模型分析血漿miRNA-200b及miRNA-21與EOC的關(guān)系

Tab.4MultivariateLogisticregressionmodelwasusedtoanalyzerelationshipbetweenplasmamiRNA-200bandmiRNA-21andEOC

FactorβSE(β)WaldOR95%CIPmiRNA?200b0 8140 2757 3842 5181 563-3 547<0 001miRNA?210 4820 1735 1461 7241 103-2 5280 018CA1250 6730 2386 2172 3161 347-3 4190 006

圖2 miRNA-200b與miRNA-21、CA125的相關(guān)性Fig.2 Correlation between miRNA-200b and miRNA-21 and CA125

3 討論

微小核糖核酸(miRNA)是一類短的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在卵巢生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其表達(dá)的缺失或過(guò)表達(dá)會(huì)顯著影響卵巢的生理功能，有望成為治療卵巢癌患者的重要靶點(diǎn)[4]。已有研究證實(shí)，miRNA在EOC中異常表達(dá)，與EOC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可作為EOC早期診斷和預(yù)后判斷的新型標(biāo)記物[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA-200b及miRNA-21在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且不同惡性腫瘤組織miRNA-200b及miRNA-21的表達(dá)譜不同，是診斷惡性腫瘤患者的潛在生物學(xué)指標(biāo)[6，7]。然而，血漿miRNA-200b及miRNA-21能否作為EOC早期診斷的分子標(biāo)志物，目前尚無(wú)定論。

本研究結(jié)果顯示，EOC組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達(dá)水平均明顯高于良性組和對(duì)照組，而良性組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。在EOC患者臨床病理分期中，Ⅲ～Ⅳ期患者血漿miRNA-200b及miRNA-21的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期。說(shuō)明血漿miRNA-200b、miRNA-21在EOC患者中異常表達(dá)，可能通過(guò)發(fā)揮癌基因的作用來(lái)調(diào)節(jié)EOC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。國(guó)外學(xué)者從多個(gè)角度研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200b可作為一種更強(qiáng)的調(diào)節(jié)因子以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的分化和上皮向基質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變，進(jìn)而參與EOC的發(fā)生發(fā)展[8]。Hu等[9]通過(guò)對(duì)55例晚期卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200b與卵巢癌的復(fù)發(fā)及生存率有關(guān)，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。另有研究表明，miRNA表達(dá)水平在EOC組織中明顯降低，可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，在EOC發(fā)生中可能存在調(diào)控關(guān)系[10]。此外，進(jìn)一步分析血漿miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)與EOC臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示兩者在腫瘤預(yù)測(cè)方面有一定的作用，分其原因可能是存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤負(fù)荷往往較大，腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的miRNA進(jìn)入血液，同時(shí)可抑制機(jī)體原有的具有抑癌作用的miRNA水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體miRNA表達(dá)水平異常升高。Zuberi等[11]研究也顯示，miRNA-200b表達(dá)水平與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)，是預(yù)測(cè)EOC患者的預(yù)后及生存的可靠標(biāo)記物。

應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示血漿miRNA-200b及miRNA-21對(duì)EOC患者的診斷效能與CA125相當(dāng)，其最佳截值分別為2.08、1.46，敏感度和特異度分別為87.5%和80.4%，84.2%和70.5%；三項(xiàng)聯(lián)合診斷EOC的敏感度和特異度較好，分別為97.2%和78.3%。相關(guān)性分析也顯示，miRNA-200b與miRNA-21、CA125之間具有良好相關(guān)性。進(jìn)一步說(shuō)明了三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)有助于提高EOC早期診斷的準(zhǔn)確性。有報(bào)道證實(shí)血漿miRNA-200b是監(jiān)測(cè)EOC的有效指標(biāo)，能夠穩(wěn)定地被檢測(cè)并能評(píng)估EOC患者的預(yù)后，有望作為EOC早期診斷的新型腫瘤標(biāo)志物[12]。

Xu等[13]研究也表明，血漿miR-21可能作為一種新的診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，可作為EOC治療的新靶點(diǎn)。本研究中，血漿miRNA-200b及miRNA-21升高是EOC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理類型、病理分級(jí)及術(shù)后有殘余腫瘤與miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)水平無(wú)關(guān)。提示miRNA-200b及miRNA-21可獨(dú)立作為EOC早期診斷的分子標(biāo)志物。Meng等[14]研究認(rèn)為，miRNA-200b是一種腫瘤診斷、治療及檢測(cè)預(yù)后極具潛能的生物學(xué)指標(biāo)。Lv等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在腫瘤組織中發(fā)揮原癌基因的作用，miRNA-21異常表達(dá)是影響腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，盡管CA125是EOC早期診斷的標(biāo)志物已有研究證實(shí)，但仍然存在一定的不足，其診斷EOC的特異度有待提高。我們初步研究表明血漿miRNA-200b及miRNA-21在EOC患者中異常表達(dá)，其對(duì)EOC的診斷效能與CA125相當(dāng)，三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)有助于提高EOC早期診斷的準(zhǔn)確性。但本研究為單中心的臨床研究，尚需多中心協(xié)作的前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步完善和豐富EOC診療評(píng)估體系。

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