血漿前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9與鈣化性主動脈瓣疾病的關(guān)聯(lián)機(jī)制①

王英歌 梁景巖 陳 露 潘 陽 張雨蒙 何凱明

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225001)

鈣化性主動脈瓣疾病(Calcific aortic valve disease，CAVD)包括病變早期的主動脈瓣硬化和晚期的主動脈瓣狹窄，是心臟科的常見病，該病往往最終導(dǎo)致主動脈瓣鈣化的病理過程[1，2]。CAVD和冠狀動脈粥樣硬化有相似的危險因素，包括年齡、吸煙、高血壓和高脂血癥[3]；而CAVD病變的早期瓣膜組織病理改變在很多方面也與冠狀動脈粥樣硬化病變類似。然而CAVD的發(fā)生機(jī)制仍不十分明確。已經(jīng)證實的是脂質(zhì)滯留、脂質(zhì)氧化和脂蛋白(a){LP(a)}參與了CAVD的發(fā)生過程[3-5]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK9)是否參與CAVD的發(fā)生過程尚不得而知。本研究擬探討血漿PCSK9水平與CAVD發(fā)生的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1研究對象 通過經(jīng)胸心臟彩超篩選2015年3月～2016年9月本院CAVD患者120例及陰性對照組患者40例。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于60歲，曾進(jìn)行心臟彩超和心臟雙源CT檢查(2種檢查間隔不超過2個月)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1月內(nèi)使用過他汀類藥物，明確診斷的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、先天性二葉主動脈瓣疾病、嚴(yán)重的二尖瓣狹窄或鈣化、嚴(yán)重的二尖瓣或主動脈瓣返流、風(fēng)濕性心臟病、心力衰竭、現(xiàn)患感染性疾病、中重度腎功能不全、現(xiàn)患或慢性肝臟疾病、酗酒或嗜藥史。本研究遵守赫爾辛基宣言并已通過我院倫理委員會倫理審查。

1.2方法

1.2.1雙源CT評價主動脈瓣 所有患者通過CT檢查進(jìn)一步對主動脈瓣鈣化程度進(jìn)行評估。CT檢查使用西門子公司雙源CT掃描機(jī)，鈣化掃描采用前瞻性心電門控觸發(fā)技術(shù)。掃描參數(shù):采用2×32×0.6層厚、旋轉(zhuǎn)時間330 ms、管電壓100～120 kV、管電流320 mA進(jìn)行掃描。在圖像后處理工作站對所有圖像進(jìn)行重建，層厚0.5 mm，重建間距0.3 mm。由2名有經(jīng)驗的CT醫(yī)師對結(jié)果進(jìn)行判讀。主動脈瓣鈣化定義為鈣化病變位于主動脈瓣瓣葉或累及主動脈根部，表現(xiàn)為斑塊在連續(xù)3個以上像素的密度大于130 HUs。首先，通過CT定量評分系統(tǒng)對主動脈瓣鈣化進(jìn)行分組：AVC 1級，主動脈瓣無鈣化；AVC 2級，主動脈瓣輕度鈣化，表現(xiàn)為小的孤立的點狀鈣化灶；AVC 3級，主動脈瓣中度鈣化，表現(xiàn)為多個大的鈣化點或鈣化灶；AVC 4級，嚴(yán)重鈣化，表現(xiàn)為所有瓣葉彌漫性鈣化[6]。其次利用鈣化積分分析軟件對瓣膜鈣化進(jìn)行分析，計算鈣化積分分值。每個病變的鈣化積分為鈣化體積乘以最大灰度值[7]，所有病變的鈣化積分之和記為鈣化總積分。

1.2.2生化指標(biāo)檢測 根據(jù)本課題組前期研究和相關(guān)研究的資料查詢，確定相關(guān)性分析時的生化指標(biāo)?？崭共裳糜贓DTA管中，3 000 r/min離心15 min，取血漿凍存于-80℃冰箱中備用。總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、載脂蛋白A1(Apo A1)及載脂蛋白B(Apo B)、LP(a)和高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)均使用羅氏c701生化分析儀測定。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的方法檢測血漿PCSK9水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件；計量資料應(yīng)用t檢驗或者方差分析，計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗。對于不符合正態(tài)分布的TG、Apo A1、LP(a)、hsCRP和PCSK9行對數(shù)轉(zhuǎn)換，相關(guān)性采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者的一般情況和實驗室指標(biāo)的比較 所有患者的平均年齡為(69.1±6.4)歲，男性94例(58.8%)，女性66例(41.2%)。52.5%患者合并高血壓，26.3%合并糖尿病，40.0%吸煙。與對照組(AVC1級)比較，AVC 2～4級在年齡、男性比例、吸煙、高血壓、糖尿病方面組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，4組患者藥物的使用亦無差別(P>0.05)。4組患者左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義，4組患者主動脈瓣鈣化積分為(0.048.6±14.5)、(114.5±37.7)及(427.8±210.3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。4組患者LDL-C、Apo B和Lp(a)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，AVC 2～4級患者明顯高于AVC1級，而TG、HDL-C、Apo A1和反應(yīng)炎癥的指標(biāo)hsCRP組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較AVC 3級和AVC 4級的TC水平高于AVC 1級組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，AVC 2～4級組患者血漿PCSK9水平高于AVC1級組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3實驗室指標(biāo)與主動脈瓣鈣化積分的相關(guān)性 將所有人群的主動脈瓣鈣化積分和生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其與TC (r=0.248,P=0.026)，LDL-C (r=0.222,P=0.048)、Lp(a)(r=0.276,P=0.013)、PCSK9(r=0.309,P=0.005)、Apo A1(r=0.245,P=0.012)、Apo B(r=0.212,P=0.019)均存在明顯相關(guān)性。但是對 CAVD 患者的分析發(fā)現(xiàn)，主動脈瓣鈣化積分與以上指標(biāo)均無相關(guān)性。另外hsCRP與主動脈瓣鈣化積分之間無相關(guān)性。PCSK9與TC、LDL、 LP(a)、 Apo A1、Apo B呈正相關(guān)，但與hsCRP無相關(guān)性，見表2。

表14組患者基線情況對比

Tab.1Baselinecomparisonof4groupsofpatients

ProjectAVC1level(n=20)AVC2level(n=18)AVC3level(n=29)AVC4level(n=13)PAge(years)67 8±5 169 7±6 168 5±7 171 5±6 40 391Male[n(%)]18(45 0)26(72 2)34(58 6)16(61 5)0 399Smoke[n(%)]12(30 0)12(33 3)26(44 8)14(53 8)0 478Hypertension[n(%)]16(40 0)16(44 4)34(58 6)18(69 2)0 306Diabetes[n(%)]10(25 0)6(16 7)16(27 6)10(38 5)0 594Theuseofdrugs[n(%)]ACEI/ARB6(15 0)14(38 9)16(27 6)12(46 2)0 211beta?blockers4(10 0)10(27 8)6(10 3)6(23 1)0 318Calciumantagonists6(15 0)8(22 2)10(17 2)4(15 4)0 939Diuretic4(10 0)4(11 1)6(10 3)6(23 1)0 660Aspirin10(25 0)18(50 0)12(20 7)8(30 8)0 182echocardiographyLVDD(mm)50 9±3 451 2±2 652 5±2 652 1±3 60 223LVEF(%)62 1±5 161 2±4 259 6±4 959 8±5 20 300DSCTparameterAorticvalvecalcificationscore048 6±14 5114 5±37 7427 8±210 3<0 001

Note：ACEI/ARB.Angiotensin converting enzyme inhibitor/angiotensin receptor antagonist；LVDD.Left ventricular end diastolic diameter；LVEF.Left ventricular ejection fraction；DSCT.Dual source CT.

表2實驗室指標(biāo)與主動脈瓣鈣化積分的相關(guān)性(Pearson相關(guān)分析)

Tab.2Correlationbetweenlaboratoryindexesandaorticvalvecalcificationscore(Pearsoncorrelationanalysis)

ProjectAllresearchpopulation(n=160)CAVDpatients(n=120)TC0 2481)0 166LDL?C0 2221)0 111Lp(a)0 2761)0 210PCSK90 3092)0 235hsCRP0 028-0 034ApoA10 2450 153ApoB0 2120 129

Note：Lp (a) and PCSK9 were analyzed by logarithmic transfor-mation.TC.Total cholesterol；LDL-C.Low density lipoprotein cholesterol；Lp(a).Lipoprotein(a)；PCSK9.Proprotein convertase subtilisin/Kexin 9；hs-CRP.High sensitive C reactive protein；Apo A1.Apolipoprotein-A1；Apo B.Apolipoprotein-B，1)P<0.05，2)P<0.01.

表3PCSK9與TC，LDL-C，Lp(a)和hsCRP相關(guān)性分析(Pearson相關(guān)分析)

Tab.3CorrelationanalysisbetweenPCSK9andTC,LDL-C,Lp(a)andhsCRP(Pearsoncorrelationanalysis)

ProjectrPTC0 535<0 001LDL0 470<0 001Lp(a)0 489<0 001hsCRP-0 106>0 05ApoA10 392<0 001ApoB0 431<0 001

Note：Lp (a) and PCSK9 were analyzed by logarithmic transform-ation.TC.Total cholesterol；LDL-C.Low density lipoprotein cholesterol；Lp(a).Lipoprotein(a)；PCSK9.Proprotein convertase subtilisin/Kexin 9；hs-CRP.High sensitive C reactive protein；Apo A1.Apolipoprotein-A1；Apo B.Apolipoprotein-B.

2.4PCSK9 與生化指標(biāo)相關(guān)性分析 PCSK9與TC、LDL、LP(a)、Apo A1、Apo B呈正相關(guān)，然而PCSK9與hsCRP無相關(guān)性，見表3。

3 討論

CAVD包括早期的以瓣膜增厚、纖維化和微鈣化為主要表現(xiàn)的主動脈瓣硬化和晚期的主動脈瓣狹窄[8]。CAVD的早期病理過程包括脂質(zhì)浸潤、炎癥反應(yīng)等，與冠狀動脈的粥樣硬化過程存在很多相似點[8]。但是CAVD的發(fā)病機(jī)理、病理過程和藥物干預(yù)的時機(jī)仍不明確。

PCSK9參加降解LDL受體，在LDL-C代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。PCSK9屬于系統(tǒng)分泌蛋白，可以結(jié)合LDL受體并將其運(yùn)至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解。PCSK9可以在人類的動脈粥樣硬化斑塊中檢測到，提示PCSK9可能同脂質(zhì)、氧化脂質(zhì)一樣參與了動脈粥樣硬化的進(jìn)展[9]。平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均在動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展中起重要作用。研究表明，平滑肌細(xì)胞的PCSK9有活性，其可以降低巨噬細(xì)胞上LDL受體數(shù)量，該實驗結(jié)果提示PCSK9在泡沫細(xì)胞的形成及動脈粥樣硬化的進(jìn)展中發(fā)揮直接作用[10]。另外，動物試驗發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)PCSK9的小鼠在高膽固醇飲食處理下容易會罹患主動脈瓣鈣化[11]。因此，研究者推測PCSK9 參與主動脈瓣的鈣化啟動過程。

本實驗結(jié)果揭示，血漿LDL-C、TC和LP(a)在主動脈瓣鈣化患者中明顯增高，與既往多數(shù)研究的結(jié)果一致[12,13]。另外,LP(a)水平與PCSK9水平存在正相關(guān)。有研究證實PCSK9 通過LDL受體調(diào)節(jié)LP(a)的分解代謝。PCSK9可以明顯降低肝臟HepG2細(xì)胞和原代人成纖維細(xì)胞的LP(a)的內(nèi)化[14]。上調(diào)HepG2細(xì)胞的LDL受體的表達(dá)可以明顯增加LP(a)的內(nèi)化，而給予LDL受體單克隆抗體治療則可顯著降低LP(a)的內(nèi)化。LDL受體在LP(a)的分解代謝中起作用，而PCSK9則對這一過程進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]。GWAS研究(全基因組關(guān)聯(lián)研究)發(fā)現(xiàn)LP(a)位點的單核苷酸多態(tài)性與CAVD的發(fā)生存在相關(guān)性[15]?；谝陨侠碚摚哂薪档蚅P(a)的藥物治療有望成為未來CAVD藥物治療的基礎(chǔ)。值得關(guān)注的是PCSK9單克隆抗體除顯著降低LDL膽固醇外，還可以降低LP(a)20%～40%[16]。

血脂與主動脈瓣鈣化之間的相關(guān)性以及主動脈瓣鈣化病變早期與動脈粥樣硬化之間的相似處導(dǎo)致以下假設(shè)：他汀有可能像改善動脈粥樣硬化的預(yù)后一樣使主動脈瓣鈣化患者獲益。早期的非隨機(jī)臨床試驗和高膽固醇血癥的動物試驗的確支持這一理論[17,18]。然而隨后針對中重度主動脈瓣狹窄患者的3項獨立的隨機(jī)對照臨床試驗卻與上述理論相悖，他汀沒能改善這兩名患者的臨床情況和預(yù)后。矛盾的結(jié)果讓我們重新審視CAVD的病理生理過程。盡管脂質(zhì)沉積和炎癥可能在CAVD的發(fā)生早期起重要作用，然而后期的鈣化、礦化階段是以鈣沉積和成骨細(xì)胞形成為特點的循環(huán)過程。一旦疾病進(jìn)入至進(jìn)展期，降脂藥物可能無效。在CAVD的早期，發(fā)生瓣膜僵硬和造成血流梗阻之前，可能是降脂藥物潛在發(fā)揮治療作用的窗口和時機(jī)。

在與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者觀察到的結(jié)果不同是，血漿PCSK9水平與CAVD患者主動脈瓣鈣化積分之間無相關(guān)性。PCSK9 水平增高除與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病風(fēng)險有所增高外，還與Gensini 評分有一定相關(guān)性[19,20]。本研究推測PCSK9與CAVD的嚴(yán)重程度無關(guān)是因為PCSK9水平僅僅在CAVD發(fā)生的初始階段起作用。

綜上所述，CAVD患者PCSK9水平明顯高于對照組，PCSK9與CAVD的發(fā)生存在相關(guān)性，而與主動脈瓣鈣化積分之間無相關(guān)性。PCSK9可能通過影響血脂代謝參與CAVD的發(fā)生和發(fā)展。

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