雞傳染性支氣管炎病毒ck/CH/LHB/121042毒株的分離鑒定及分子特征研究

馬得瑩，姜 磊,，許麗文,，劉亮亮,，韓宗璽

（1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室禽傳染病研究室，哈爾濱 150001）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）為傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要引起高傳染性呼吸道、生殖器官和泌尿系統(tǒng)疾病[1-2]。根據(jù)傳染性支氣管炎臨床癥狀和主要病變部位不同，將其分為呼吸型、生殖型、腎型和腺胃型等多種類型。任何年齡段雞均易感染IBV，但1～4周齡雞更敏感[3]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為精神沉郁、咳嗽、呼吸困難、死亡等[4-5]。IBV可感染組織器官纖毛上皮細胞，如腎臟、生殖器官和腸神經束，產生腎炎，導致雞生殖障礙，產蛋量下降，蛋品質降低。IBV自1980年在我國第一次出現(xiàn)，不同地區(qū)流行IBV類型復雜多樣，不同類型毒株間交叉反應較小，對我國傳染性支氣管炎防控帶來新挑戰(zhàn)[6]。

IBV為冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）代表成員[7]，為單股正鏈RNA包膜病毒，全長約27.6 kb，IBV有兩個較大開放閱讀框（ORF），ORF1a和ORF1b[8]，約占據(jù)病毒全基因組2/3，編碼病毒復制酶，IBV含四個結構蛋白，即纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核蛋白（N）和小分子膜蛋白（E），卷曲多聚體S蛋白在轉錄后被切割成兩段，S1和S2[9]，S1包含高度可變區(qū)，與病毒免疫原性、血清型、組織嗜性、致病性和遺傳變異等有關[10-11]。與S1基因相比，S2基因相對較保守，其C端含疏水性氨基酸集中區(qū)，與病毒膜融合有關[12]。S1基因常用于鑒定IBV基因型相關基因。

近年我國大陸TWⅠ型毒株分離數(shù)量不斷增多[13]。TWⅡ型毒株2010年在河北首次分離[14]。Xia等研究發(fā)現(xiàn)我國西南部地區(qū)出現(xiàn)QX型毒株與TWⅡ型毒株重組毒株[15]。本研究通過病料病毒分離和鑒定、全基因組測序等分析，確定該病毒基因型為TWⅡ型。進一步研究其分子特征，明確該病毒分離株遺傳演化規(guī)律，為IBV流行病學調查提供理論依據(jù)，也為研制針對該流行毒株疫苗及制定有效防控IBV流行措施等提供理論基礎，并可預測未來IBV毒株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

2012年采自河北省某雞場疑似IB瀕死蛋雞腎臟。

1.1.2 SPF雞胚

SPF雞胚由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.1.3 引物、載體和菌株

參照已發(fā)表的Beaudette（M95169）IBV株設計[14]19對引物用于擴增IBV全基因組序列，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成?？寺≥d體pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司，受體菌為大腸桿菌TG1，由本實驗室保存。

1.1.4 主要試劑

Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）均購自寶生物工程（大連）有限公司，RNAiso Plus及3'-Full RACE Kit和5'-Full RACE Kit購自日本TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司，所用試劑三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離與鑒定

取病雞腎臟于無菌2 mL EP管中，參照文獻[16]方法處理組織，上清液用0.22μm微孔濾器除菌，取0.2 mL接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔中，37℃孵化箱孵育，棄去24 h死亡胚，無菌條件下收取72 h雞胚尿囊液再接種雞胚，按上述方法將病毒尿囊液在雞胚中盲傳3代后作PCR鑒定。收集第三代PCR鑒定為陽性雞胚尿囊液1.5 mL，于4℃、12 000 r·min-1離心30 min，棄掉部分上清液，將剩余尿囊液混勻；取適量病毒尿囊液，用2%磷鎢酸染色1 min，電鏡下觀察病毒形態(tài)。

1.2.2 病毒血凝活性測定

按常規(guī)方法制備1%雞外周血紅細胞，取各代尿囊液作血凝試驗[17]，檢測尿囊液中是否含血凝活性病原微生物。

1.2.3 病毒RNA提取和RT-PCR鑒定

按文獻[18]方法處理尿囊液，按照Trizol試劑盒說明書提取RNA，最后用30μL DEPC水溶解，儲存于-70℃冰箱備用，以其為模板，以[N（+）]：5'-ACGCGGAGTAGGATCGAGGGTACA-3'和[N（-）]：5'-GACGCCCCAGCGCCAGTCATTAAA-3'為上下游引物，37℃條件下反應2 h反轉錄[16]。參照文獻[19]PCR程序擴增病毒基因片段，病毒基因組3'末端和5'末端參照3'-Full RACE和5'-Full RACE說明書作基因擴增。目的條帶回收克隆到pMD18-T中，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 病毒ORF確定、病毒全基因組和S1蛋白基因序列分析

用GeneRunner3.0軟件確定ck/CH/LHB/121042病毒分離株ORF，利用DNAStar軟件中MEGALIGN程序ClustalW方法對比和分析序列，MEGA5.0最大似然法（Maximum Likelihood，ML）選取35株IBV作遺傳演化分析，55株毒株S1基因作系統(tǒng)進化樹分析，MAFFT方法比較55株毒株S1基因高變區(qū)氨基酸差異。

2 結果

2.1 病毒分離和鑒定

接種組織研磨上清液SPF雞胚，第二代出現(xiàn)病變，照蛋時胚體矮小，運動緩慢，從氣室端打開雞胚可見雞胚蜷曲成球狀，伴隨透明水泡，雞胚絨毛彎曲，胚體彌漫出血，羊膜增厚并黏連在胚體上，將培養(yǎng)3 d病變雞胚與培養(yǎng)7 d對照胚打開（見圖1）。病毒顆粒在電鏡下呈球形，直徑80～120 nm，囊膜表面有疏松排列棒狀突起，為典型冠狀病毒顆粒形態(tài)學特征（見圖2），將病毒分離株命名為ck/CH/LHB/121042。

圖1 培養(yǎng)3 d病變胚（左）和培養(yǎng)7 d對照胚（右）Fig.1 Comparison of chicken embryo with lesion(left)and control(right)

圖2 病毒粒子形態(tài)電鏡觀察Fig.2 Morphological observation of virusby electron-microscope

2.2 病毒分離株全基因組擴增、克隆及測序

從病毒分離株中分別擴增與預計大小相等19條目的片段，將擴增產物克隆于pMD18-T載體中，篩選陽性重組質粒，每個片段送3個獨立克隆測序，確保病毒分離株每個片段基因序列準確性。

2.3 病毒分離株血凝試驗

對盲傳三代含病毒分離株尿囊液作血凝試驗，結果顯示該病毒分離株未使雞外周血紅細胞發(fā)生凝集，該尿囊液中無血凝活性的外源病毒。

2.4 病毒全基因組序列的測定及ORF推測

拼接病毒中獲19個基因片段，ClustalW方法與參考毒株ck/CH/LHB/100801對比，結果顯示兩個毒株之間核苷酸同源性達99.9%，病毒分離株ck/CH/LHB/121042基因組特征為5'UTR-1a-1b-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-3'UTR（見表1），與IBV基因組學特征相符，基因組全長27 675 bp，病毒整個基因組普遍存在堿基缺失、插入和突變，與參考毒株相比，ORF1中缺失和插入相對較多。該分離株基因組GenBank注冊號為MG448607。

2.5 分離株ck/CH/LHB/121042全基因組序列分析

選擇GenBank已提交34株IBV毒株作為參考，與分離株病毒全基因組作遺傳演化分析，結果顯示，分離株ck/CH/LHB/121042與ck/CH/LHB/100801親緣關系最近，屬TWⅡ型毒株，其次與TWⅠ毒株3375/08和TW2575/98親緣關系較近（見圖3）。

表1 ck/CH/LHB/121042推測ORFTable1 Open reading framesencoded in ck/CH/LH/121042 genome

圖3 病毒分離株ck/CH/LHB/121042基因組序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysisof isolateck/CH/LHB/121042 based on completegenomic sequenceswith IBV referencestrains

2.6 ORF1遺傳特征

病毒分離株ck/CH/LHB/121042ORF1全長19934bp，包括兩個開放閱讀框，ORF1a和ORF1b，前者由11910個核苷酸編碼3969個氨基酸殘基，后者由7950個核苷酸編碼2650個氨基酸殘基。ck/CHLHB/121042與參考毒株ck/CH/LHB/100801具有相同“滑脫序列”，即“TTTAAAC”。與參考毒株相比，ck/CH/LHB/121042ORF1a區(qū)共缺失17個堿基，主要分布在核苷酸 875～877位、879～888位、894位、904～905位和942位，另在核苷酸10 782位有堿基序列“TTACCTATTGCTACAGTTCAATCTAAGTTGA GTGATGTAAA”插入，缺失堿基導致推導的氨基酸序列只編碼917個氨基酸殘基提前終止，又從核苷酸1042位開始編碼；插入堿基導致推導的氨基酸序列3594～3608位連續(xù)突變8個氨基酸，病毒編碼3 256個氨基酸后提前終止。ORF1b區(qū)，核苷酸12 756位插入一個堿基，核苷酸13 838～13 844位缺失6個堿基，插入堿基導致氨基酸4 252位及4 254～4 259位共7個氨基酸發(fā)生突變，ORF1b編碼氨基酸提前終止；缺失堿基導致ORF1b推導的氨基酸序列4 612～4 613位缺失1個氨基酸。

2.7 ck/CH/LHB/121042主要結構蛋白基因遺傳特征

ck/CH/LHB/121042分離株S基因序列測定結果表明，此分離株S基因由3492個核苷酸組成，編碼1163個氨基酸殘基。推測核苷酸在距離S基因起始密碼子1 600位，即氨基酸534位有5個氨基酸殘基“Arg-Arg-Phe-Arg-Arg”組成酶識別位點，將S基因裂解成兩段，S1亞基由1614個核苷酸組成，編碼含538個氨基酸殘基多肽，S2亞基由1878個核苷酸組成，編碼625個氨基酸殘基多肽。

在系統(tǒng)進化樹分析中，ck/CH/LHB/121042與ck/CH/LHB/100801、 ck/CH/LSD/110856、 TW2296/95、T07/02等為第Ⅱ群，S1亞基核苷酸同源性較高，且ck/CH/LHB/121042與ck/CH/LHB/100801核苷酸同源性最高，為99.9%（見圖4），與其他血清型毒株S1亞基核苷酸和氨基酸對比結果（見表2）顯示，ck/CH/LHB/121042分離株與TWⅡ型毒株同源性最高，分別為94.1%～99.9%和88.8%～99.6%。與參考毒株相比，ck/CH/LHB/121042S1亞基核苷酸突變?yōu)閮商帲鶠橛辛x突變，即發(fā)生兩個氨基酸突變；S2亞基出現(xiàn)1個堿基位點突變，產生1個氨基酸突變。

圖4 ck/CH/LHB/121042病毒分離株與54個參考毒株S1基因分析Fig.4 Phylogenetic analysisof isolateck/CH/LHB/121042 based on S1 genewith 54 IBV referencestrains

MAFFT方法比較55株毒株S1基因氨基酸差異，發(fā)現(xiàn)此分離株有兩個高變區(qū)HVR1和HVR2（見表3），HVR1為氨基酸56～85位，HVR2為氨基酸126～157位，ck/CH/LHB/121042與其他血清型之間氨基酸突變較多，與TWⅡ型毒株相比突變較少，與ck/CH/LHB/100801氨基酸完全相同，無突變。

表2 ck/CH/LHB/121042與其他血清型毒株S1基因核苷酸和氨基酸殘基比較Table2 Pairwisecomparison of nucleotidesand amino acidsof the S1 geneof ck/CH/LHB/121042 with other serotypestrains

表3 55株IBV毒株HVR1和HVR2突變氨基酸比較Table3 Comparison of amino acid mutation of HVR1 and HVR2 of 55 strains

ck/CH/LHB/121042分離株M基因由678個核苷酸組成，編碼225個氨基酸殘基組成多肽。ck/CH/LHB/121042分離株M基因與TW2296/95、ck/CH/LHB100801核苷酸同源性分別為100%和99.7%，與ck/CH/LHB/100801相比有兩處堿基位點發(fā)生突變，產生兩個氨基酸突變。

ck/CH/LHB/121042分離株N基因由1 230個核苷酸組成，編碼409個氨基酸殘基組成的多肽。與ck/CH/LHB/100801相比有一處堿基位點發(fā)生突變。ck/CH/LHB/121042分離株N基因與ck/CH/LHB/100801核苷酸同源性為99.9%。

ck/CH/LHB/121042分離株5'UTR和3'UTR分別有587和465個核苷酸，與ck/CH/LHB100801毒株5'UTR和3'UTR核苷酸同源性均為100%。

續(xù)表

3 討 論

近年來我國IBV流行毒株復雜，存在出現(xiàn)突變型毒株甚至重組型毒株可能[6,9]。本研究通過病料IBV分離和鑒定、序列分析等，確定該分離株ck/CH/LHB/121042為TWⅡ型毒株。目前我國流行病學調查鮮有TWⅡ型毒株報道，但多省份出現(xiàn)TW型毒株，西南部地區(qū)出現(xiàn)QX型與TWⅡ型重組毒株等，原因不明。因此，該病毒分離株回顧性研究尤為重要，本研究可為探析新型毒株或重組型毒株出現(xiàn)原因及進化演變規(guī)律提供參考。

近年來，世界各地相繼出現(xiàn)新基因型或突變型IBV，原因為病毒S1亞基點突變積累、堿基位點缺失、插入和重組等。IBV基于S1基因不同而分型，為IBV流行病學分析、分型、遺傳演化研究提供依據(jù)，因此基于S1基因作系統(tǒng)進化樹分析成為研究IBV演化有效措施[20]。本研究篩選不同血清型55株毒株對其S1基因作系統(tǒng)進化樹分析，分離株ck/CH/LHB/121042與2010年在河北分離得到TWⅡ型毒株ck/CH/LHB/100801同源性最高，系統(tǒng)發(fā)育樹中兩者在同一分支，病毒全基因組序列經BLASTn后與ck/CH/LHB/100801核苷酸同源性為99.9%，選取34株IBV毒株作全基因組遺傳演化分析，得到相同結果。以上結果表明，分離株ck/CH/LHB/121042與TWⅡ型毒株ck/CH/LHB/100801為同一基因型和血清型，兩株毒株可能具有相同遺傳進化規(guī)律，且與臺灣地區(qū)分離病毒同源性極高，但河北省與臺灣地區(qū)地理位置相對較遠，推測IBV流行形勢相關性可能與攜帶IBV禽類遷徙有關，但不排除禽類疫苗使用不當造成IBV重組。

IBV不同血清型、基因型、免疫表型間存在相關性，相同血清型毒株之間氨基酸相似度達95%以上[21]，不同血清型之間則低于85%[22]。研究表明，2004年臺灣地區(qū)分離株2296/92與大陸血清Ⅶ型，如CK/CH/LDL/97I，核苷酸同源性達95%以上[23]，2010年分離病毒ck/CH/LHB/100801與臺灣地區(qū)分離株TW2296/95核苷酸同源性為99.8%[13]，說明不同地域也會出現(xiàn)相同或相似血清型病毒，可能與攜帶傳染性支氣管炎病毒鳥類長途遷徙有關[24]。本研究中，分離株ck/CH/LHB/121042與TWⅡ型分離株ck/CH/LHB/100801S1基因和全基因組相似度均達95%以上，S1基因2個氨基酸殘基發(fā)生突變，但未使病毒分離株基因型和血清型發(fā)生變化。我國流行IBV類型復雜，基因型或血清型以LX4（QX）和自然重組TWI型為主，同時存在其他多種類型毒株以及變異株。揚州大學農業(yè)部畜禽傳染病重點開發(fā)實驗室在2009～2015年流行病學監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，全國各地發(fā)病雞中分離150株IBV，其中LX4型毒株105株，占總數(shù)70.0%，TWⅠ型排名第二位[25]；Gao等調查研究發(fā)現(xiàn)，TWⅠ型IBV于2010年開始在我國河北、黑龍江、山東、吉林、遼寧等地免疫雞群中分離，逐漸成為主要流行毒株類型，這些地區(qū)IBV流行毒株形式發(fā)生變化可能與不同地區(qū)免疫接種程序、家禽密度、飼養(yǎng)習慣、養(yǎng)殖環(huán)境等因素有關[26]。本研究從河北省分離的ck/CH/LHB/121042為TWⅡ型毒株，不屬于我國主要流行毒株，一定程度上反映河北當?shù)豂BV流行形勢復雜性。由于此分離株ck/CH/LHB/121042與2010年在該地分離的ck/CH/LHB/100801屬同一血清型病毒，推測此型病毒出現(xiàn)后一直存在并普遍流行，至今是否發(fā)生更多突變或與其他病毒發(fā)生重組尚不明確，病毒是否傳播至河北其他地區(qū)需進一步流行病學監(jiān)控，該病毒防控和治療有效性仍需調查。

4 結 論

本研究從河北省某雞場蛋雞疑似IB病雞腎臟中分離一株IBV，命名為ck/CH/LHB/121042。通過進一步研究其分子特征等發(fā)現(xiàn)，ck/CH/LHB/121042分離株與ck/CH/LHB/100801同源性最高，病毒基因型為TWⅡ型。

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