黃瓜CsCBS克隆及其對(duì)霜霉病和棒孢葉斑病抗性功能的初步驗(yàn)證

秦智偉，王奕童，劉 東，辛 明，周秀艷

（1.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

黃瓜（Cucumissativus L）屬于葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物，生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)受真菌、細(xì)菌等病原菌侵染，導(dǎo)致產(chǎn)量及品質(zhì)下降?；瘜W(xué)藥劑防治不僅增加生產(chǎn)成本、污染環(huán)境、影響食品安全，且導(dǎo)致病原菌抗藥性，因此選育及利用抗病品種十分必要。

黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病是黃瓜生產(chǎn)中主要病害，分別由藻界卵菌門古巴假霜霉菌〔Pseudoperonospora cubensis（Berk.&M.A.Curtis）Rostovzev〕和 多 主 棒 孢 霉〔Corynespora cassiicola（Berk &Curt，Wei）〕侵染引起葉部病害，嚴(yán)重時(shí)可造成黃瓜減產(chǎn)60%以上。

丁國(guó)華，孟攀奇等認(rèn)為黃瓜霜霉病抗性由1個(gè)隱形基因控制[1-2]。也有多個(gè)隱性基因參與調(diào)控黃瓜霜霉病抗性，張素勤等發(fā)現(xiàn)霜霉病抗性由2對(duì)主基因控制[3]；Kozik等研究表明霜霉病抗性由多基因決定[4]。目前，有關(guān)黃瓜棒孢葉斑病抗性基因研究較少，Adam等認(rèn)為黃瓜抗棒孢葉斑病由1對(duì)顯性基因控制[5]；王惠哲等發(fā)現(xiàn)1對(duì)隱形單基因控制黃瓜棒孢葉斑病[6]；Wang等發(fā)現(xiàn)由單隱性基因控制黃瓜棒孢葉斑病[7]。

挖掘抗性基因可為黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病的雙抗分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。Bateman根據(jù)胱硫醚β合成酶（cystathionine beta synthase，CBS）命名CBS結(jié)構(gòu)域[8]。CBS結(jié)構(gòu)域具有多種功能，如氯離子通道、蛋白間相互作用、細(xì)胞內(nèi)離子強(qiáng)度、細(xì)胞質(zhì)靶向與細(xì)胞能量狀態(tài)傳感器等[9]，CBS結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域活性，響應(yīng)腺苷與分子結(jié)合，如AMP、ATP或S-腺苷甲硫氨酸[10]。CBS結(jié)構(gòu)域通常存在于酶促、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或DNA結(jié)合活性蛋白質(zhì)中，但僅含CBS結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)也存在于原核生物中。獨(dú)立CBS結(jié)構(gòu)域蛋白可能與其他蛋白（如激酶）結(jié)合形成復(fù)合物并相互作用[11]。

目前CBS結(jié)構(gòu)域集中于人類相關(guān)疾病，如含CBS結(jié)構(gòu)域PRL-2-CNNM3蛋白復(fù)合物可抑制乳腺癌增殖和腫瘤生長(zhǎng)[12]，CBS結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變引起各種嚴(yán)重疾病，包括高胱氨酸尿癥，肥厚性心肌病和色素視網(wǎng)膜炎[13]。PCS中發(fā)現(xiàn)CBS結(jié)構(gòu)域大部分錯(cuò)義突變導(dǎo)致家族性心室預(yù)激綜合征，引起傳導(dǎo)缺陷和心臟肥大[14]，但CBS結(jié)構(gòu)域蛋白在植物中作用研究成果有限。

本研究在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上[15]，篩選10個(gè)基因（在抗病品種中上調(diào)表達(dá)基因且在感病品種中下調(diào)表達(dá)或無(wú)差異表達(dá)基因），包含果膠裂解酶基因、蛋白激酶家族基因、BAG家族基因、CBS結(jié)構(gòu)域蛋白基因、赤霉素調(diào)節(jié)蛋白基因、ERF轉(zhuǎn)錄因子、bHLH157轉(zhuǎn)錄因子、鋅指蛋白基因、鈣調(diào)素蛋白基因和CCT基序蛋白基因，挑選含有CBS結(jié)構(gòu)域基因Csa6M496430.1，命名為CsCBS。通過(guò)CsCBS作克隆及功能驗(yàn)證，明確該基因在黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病抗性中作用，旨在為黃瓜雙抗分子機(jī)理研究及黃瓜多抗品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取抗病品種‘D9320’和感病品種‘D0401’作為試材[16]，種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.2 接種方法

1.2.1 菌懸液配制

霜霉病菌菌懸液制備：于2016年6月黃瓜生長(zhǎng)季節(jié)，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站黃瓜大棚中采集黃瓜霜霉病病葉。用毛刷將霜霉病菌刮至無(wú)菌水燒杯中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配制接種懸浮液。

棒孢葉斑病菌菌懸液制備：將黃瓜棒孢葉斑病菌于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，28℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d。無(wú)菌水沖洗分生孢子，無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配制孢子懸浮液。

1.2.2 接種處理

接種處理分為單一接種棒孢葉斑病菌、霜霉病菌和同時(shí)接種兩種病原菌共3個(gè)處理，具體參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。

培養(yǎng)條件均為接種后保濕24 h，白天光照26℃/16 h，夜晚黑暗18℃/8 h，設(shè)置清水為對(duì)照組。分別在接種后2、4、8、12、24、36、48、72、96、120 h取樣，液氮處理后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CsCBS基因克隆及生物信息學(xué)分析

在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上[16]，選擇與對(duì)照相比在抗病品種中表達(dá)上調(diào)的差異基因，在感病品種中無(wú)差異表達(dá)基因Csa6M496430.1。在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中確定該基因CDS序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），用蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析CsCBS作蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。MAGE5.10軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 表達(dá)模式分析

以在線軟件https://www.genscript.com/tools/realtime-pcr-tagman-primer-design-tool作引物設(shè)計(jì)，所用引物見(jiàn)表1，參照基因?yàn)镃sEF1α（GenBank Accession Number:XM_004138916），試驗(yàn)共3次生物學(xué)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCT相對(duì)定量分析方法計(jì)算，student t檢驗(yàn)作樣本比較，“*”代表對(duì)應(yīng)柱值與對(duì)照柱值差異顯著，“**”代表對(duì)應(yīng)柱值與對(duì)照柱值差異極顯著。

1.5 CsCBS亞細(xì)胞定位

構(gòu)建CsCBS與GFP融合表達(dá)載體，設(shè)計(jì)帶有HindⅢ和Bam HⅠ酶切位點(diǎn)引物（見(jiàn)表1），擴(kuò)增獲去掉終止密碼子CsCBS開放讀碼框。構(gòu)建pEASYT3-CsCBS載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1于大腸桿菌中并鑒定測(cè)序，將pEASY-T3-CsCBS瞬時(shí)表達(dá)載體質(zhì)粒和pGII-eGFP載體質(zhì)粒用快速內(nèi)切酶 HindⅢ和Bam HⅠ雙酶切，膠回收得純化產(chǎn)物，將目的基因片段與載體片段用 T4連接酶連接，獲得融合表達(dá)載體 35S-CsCBS-eGFP，轉(zhuǎn)化Trans1-T1于大腸桿菌中并鑒定。

原生質(zhì)體提取及轉(zhuǎn)化過(guò)程參照文獻(xiàn)[18]。以激光共聚焦顯微鏡（TCS SP2 Leica，德國(guó)）觀察。

1.6 黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化

使用克隆全長(zhǎng)引物（見(jiàn)表1），以pEASY-T3-CsCBS質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增目的基因， PCXSN-1250載體以XcmⅠ單酶切。T4連接酶連接目的片段與載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。通過(guò)菌液PCR及測(cè)序鑒定構(gòu)建PCXSN-CsCBS過(guò)量表達(dá)載體，凍融法將構(gòu)建的過(guò)量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。

運(yùn)用文獻(xiàn)[19]中黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，抗性及濃度為草丁膦100 mg·L-1，轉(zhuǎn)化黃瓜子葉。PCR及qPCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株作分子鑒定[19]。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定

qRT-PCR技術(shù)對(duì)過(guò)表達(dá)CsCBS株系作CsCBS表達(dá)分析。選擇3株表達(dá)量最高轉(zhuǎn)基因植株真葉接種處理，分別接種棒孢葉斑病菌（孢子濃度為1.0×105個(gè)孢子·mL-1）和霜霉病菌（孢子囊濃度為2.0×103個(gè)孢子囊·mL-1）。培養(yǎng)條件為接種后保濕24 h，白天光照26℃/16 h，夜晚黑暗18℃/8 h。非轉(zhuǎn)基因植株作對(duì)照。葉片病害癥狀使用Nikon D5500相機(jī)拍攝，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[17]。測(cè)定過(guò)表達(dá)植株生理指標(biāo)，硫代巴比妥酸方法測(cè)定丙二醛，蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖[20]。用單因素試驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)分析，“*”代表對(duì)應(yīng)柱值與對(duì)照柱值差異顯著，“**”代表對(duì)應(yīng)柱值與對(duì)照柱值差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCBS基因克隆及序列分析

利用RT-PCR技術(shù)，以接種后‘D9320’黃瓜葉片提取RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA克隆CsCBS基因CDS區(qū)全長(zhǎng)。CsCBS基因包含一個(gè)1 263 bp開放閱讀框，編碼420個(gè)氨基酸，含有1個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域和1個(gè)DUF結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖1），起始密碼子ATG，終止密碼子TAG。具有CBS結(jié)構(gòu)域蛋白存在于水稻和擬南芥中，根據(jù)CBS結(jié)構(gòu)域數(shù)量分為兩大類，其中一類僅含1個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域，根據(jù)所含其他結(jié)構(gòu)域種類分為 CBSX； CBSDUF； CBSDUFCH； CBSCLC；CBSSIS；CBSPPR；CBSIMPDH 。另一類包含兩個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域，分為CBSCBS和CBSPB1[9]。用MAGE5.10軟件，將序列作多重比對(duì)并以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖2可知，CsCBS屬于CBSDUF成員。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

2.2 兩種病原菌脅迫下CsCBS表達(dá)模式分析

在抗病品種‘D9320’和感病品種‘D0401’中，CsCBS對(duì)病原菌脅迫響應(yīng)模式不同。如圖3a所示，在抗病品種‘D9320’中，單一接種霜霉病、棒孢葉斑病菌及同時(shí)接種2種病原菌3個(gè)處理下，從接種2～24 h，CsCBS表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，為表達(dá)量高峰期。其中，單一接種棒孢葉斑病菌處理一直處于高表達(dá)水平，高于對(duì)照12～16倍；同時(shí)接種2種病原菌處理在4 h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照57倍，24 h開始顯著下降，至72 h仍顯著高于對(duì)照。36～120 h，兩單一處理表達(dá)量顯著下降，與對(duì)照處于相同水平。由圖3a可知，CsCBS對(duì)棒孢葉斑病菌響應(yīng)更強(qiáng)烈，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，2～12 h極顯著高于對(duì)照。

感病品種‘D0401’在病原菌脅迫下，CsCBS基因表達(dá)量（見(jiàn)圖3b）僅在4 h單一接種霜霉病菌時(shí)顯著高于對(duì)照，其余時(shí)間均低于對(duì)照或與對(duì)照持平，表達(dá)量極低，近似直線。

圖2 CsCBS進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis CsCBS

圖3 CsCBS在抗感品種不同接種處理下相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relativeexpression of CsCBS under different inoculation treatmentsin resistant and susceptible varieties

通過(guò)比較圖3a和b可知，CsCBS在抗病品種‘D9320’與感病品種‘D0401’中表達(dá)模式存在差異?？共∑贩N‘D9320’中CsCBS表達(dá)先高后低，2～24 h處于高表達(dá)狀態(tài)，36～120 h除單一接種棒孢葉斑病菌處理外，其余表達(dá)量低且平穩(wěn)；在感病品種‘D0401’中，CsCBS表達(dá)量低于對(duì)照或與對(duì)照持平，始終處于低水平。

2.3 CsCBS亞細(xì)胞定位

將CsCBS-GFP融合表達(dá)載體和GFP空載體分別轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中，在共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示CsCBS-GFP綠色熒光分布于細(xì)胞質(zhì)中（見(jiàn)圖4），證明CsCBS屬于細(xì)胞質(zhì)蛋白。

圖4 CsCBS蛋白亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of CsCBS protein

2.4 轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)及表型鑒定

以PCXSN-1250載體引物作PCR鑒定，出現(xiàn)1 500 bp左右目的條帶的為陽(yáng)性植株（見(jiàn)圖5），共鑒定出16株陽(yáng)性植株。將所得陽(yáng)性植株作qRTPCR表達(dá)量分析，篩選CsCBS表達(dá)量最高3株（S1、S2、S3）轉(zhuǎn)基因植株。CsCBS表達(dá)量分別為對(duì)照226、133、153倍（見(jiàn)圖6）。

圖5 過(guò)表達(dá)植株P(guān)CR鑒定Fig.5 PCR identification of overexpressed plants

圖6 過(guò)表達(dá)植株CsCBS基因表達(dá)量Fig.6 Expression of CsCBS in over-expression transgenic plants

對(duì)S1、S2、S3及對(duì)照植株真葉作離體接種處理，接種7 d后，感染霜霉病菌轉(zhuǎn)基因植株S1、S2、S3葉片褪綠面積約15%～20%，與抗病品種‘D9320’相同；感病品種‘D0401’葉片褪綠面積大于95%；感染棒孢葉斑病菌轉(zhuǎn)基因植株S1、S2、S3葉片褪綠面積約5%～20%，與抗病品種‘D9320’基本相同。感病品種‘D0401’葉片褪綠面積大于40%（見(jiàn)圖7）。可見(jiàn)，在感病品種D0401中過(guò)表達(dá)CsCBS后，顯著增強(qiáng)其對(duì)霜霉病和棒孢葉斑病抗性。

2.5 黃瓜轉(zhuǎn)基因T 0代植株生理生化指標(biāo)測(cè)定

從過(guò)表達(dá)CsCBS植株中選擇表達(dá)量高3株作相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。由圖8a可知，在過(guò)表達(dá)植株中丙二醛含量極顯著低于對(duì)照植株，低于對(duì)照植株2.1～3.2倍。

由圖8 b中知，在過(guò)表達(dá)植株中可溶性糖含量極顯著高于對(duì)照植株，高于對(duì)照植株1.5～1.6倍。

圖7 黃瓜感病品種D0401過(guò)表達(dá)CsCBS的T 0代植株接種發(fā)病癥狀Fig.7 Expression levelsof the CsCBS in the T 0-generation CsCBS-overexpressing plants

圖8 轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛、可溶性糖含量Fig.8 Transgenic plants malondialdehydeand solublesugar content

3 討論與結(jié)論

王曉敏等研究表明在小麥中TaCDCP1可能通過(guò)脫落酸信號(hào)途徑參與小麥對(duì)條銹菌防御反應(yīng)[21]；OsCBS過(guò)表達(dá)后增強(qiáng)水稻在鹽、重金屬和氧化應(yīng)激條件下耐受性[9]；彩葉草中cbCBS基因隨葉片衰老上調(diào)表達(dá)[22]；OsBi1在褐飛虱侵害后表達(dá)上調(diào)，在維管束周圍累積表明其為一種防御基因，與韌皮部吸允損傷有關(guān)[23]；大豆中GmCBS21基因過(guò)表達(dá)可提高植物低氮條件下耐受性[18]；目前，CBS結(jié)構(gòu)域蛋白在黃瓜抗病中作用未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，CsCBS基因在3個(gè)接種處理下，抗病品種‘D9320’中持續(xù)上調(diào)前期表達(dá)，感病品種‘D0401’中無(wú)顯著變化，說(shuō)明CsCBS基因可積極響應(yīng)霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫。在‘D9320’中，4 h雙接種處理下表達(dá)量高于對(duì)照57倍，CsCBS基因表達(dá)量驟升并高于其他兩個(gè)接種處理，可能在4 h時(shí)2種病菌侵染進(jìn)程存在協(xié)同作用，顯著誘導(dǎo)CsCBS表達(dá)，說(shuō)明CsCBS基因可能在病原菌侵染初期起重要作用。但CsCBS基因具體對(duì)哪種病菌先出現(xiàn)抵抗作用，抵抗方式如何，尚需試驗(yàn)證明。用離體接種法對(duì)過(guò)表達(dá)植株作表型鑒定，結(jié)果表明在感病材料‘D0401’中過(guò)表達(dá)CsCBS后，發(fā)病癥狀明顯輕于對(duì)照，說(shuō)明過(guò)表達(dá)CsCBS提高黃瓜對(duì)霜霉病和棒孢葉斑病抗性，在黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病中發(fā)揮作用。本研究?jī)H針對(duì)T0代植株鑒定，植株較少，在T1～T3代中能否穩(wěn)定遺傳，是否對(duì)兩種病害均有抗性，仍需驗(yàn)證。

劉會(huì)寧等認(rèn)為，MDA含量與植物抗病性呈負(fù)相關(guān)，葡萄感染黑痘病后，不同品種MDA均上升[24]；白粉病侵染紫薇后，抗病品種MDA低于感病品種[25]（如圖8a），過(guò)表達(dá)植株中MDA含量顯著低于對(duì)照，證明CsCBS基因可降低質(zhì)膜過(guò)氧化程度，提高植物抗病性。

另外，在黃瓜侵染霜霉病后，受害葉片中可溶性糖含量上升，與抗病性呈正相關(guān)[26]?？扇苄蕴呛扛撸苯房挂卟∧芰?qiáng)[27]，利于水稻抗稻瘟病[28]，提高苦瓜對(duì)白粉病抗性[29]，與本研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)研究CsCBS基因在黃瓜霜霉病及棒孢葉斑病脅迫下作用，分析CsCBS是否具有雙抗病性。后續(xù)將深入研究CsCBS抗兩種黃瓜病害之間是否存在協(xié)同作用，CsCBS基因如何發(fā)揮作用及可否穩(wěn)定遺傳。

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