長爪沙鼠近交系培育中血液生理生化指標(biāo)的變化

李 迎, 杜小燕, 崔曉霞, 馬蘭芝, 尚世臣,何曉亞, 黃 斌, 趙 權(quán), 李桂軍, 王冬平, 陳振文

(1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 北京 100071;2. 首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部, 北京 100069;3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長春 130118)

長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)在解剖學(xué)、生理學(xué)等方面有許多獨(dú)特的生物學(xué)特征，已被廣泛用于醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域[1,2]。近年來,因其腦底動(dòng)脈環(huán)前后交通支存在不同程度的缺失，不能構(gòu)成完整的Willis動(dòng)脈環(huán)的特性而成為天然的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，作為腦缺血或腦梗塞研究的理想模型[3]。本研究是通過親代腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失表型一致性長爪沙鼠子代進(jìn)行兄妹交配，定向培育出了腦缺血模型長爪沙鼠近交系，針對該近交系動(dòng)物培育過程中近交第11至20代(F11到F20)的血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化檢測，探索變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境 普通級腦缺血模型近交系長爪沙鼠120 余只。其中F11～12代 6只(雌4,雄4); F13～14代40只(雌21, 雄19); F15～16代24只(雌12，雄12); F17～18代30只(雌15，雄15);F19～20 代24 只(雌14, 雄10), 年齡為1.5～2.5 年,雌性體質(zhì)量為68.29～82.09 g, 雄性體質(zhì)量為65.63～85.40 g, 均為各代繁殖種鼠，均由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 動(dòng)物飼養(yǎng)于普通級環(huán)境內(nèi), 室溫為20～24 ℃, 日常飼喂60Co照射消毒飼料及飲用無菌水，動(dòng)物自由采食及飲水。本實(shí)驗(yàn)通過首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)(No.AEEI-2017-032)。

1.1.2 主要試劑儀器 美國Beckman公司提供生化各項(xiàng)指標(biāo)的配套試劑； 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的配套試劑為上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號: YZB/滬 0552-40A-2012。Beckman全自動(dòng)生化分析儀(CX5)，日本光電全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(MEK-7222K)(動(dòng)物參數(shù)), 低溫離心機(jī)(CF16RX)。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集和處理 動(dòng)物空腹12～24 h, 眼眶靜脈取血, 靜止30 min, 5000 r/min離心10 min制備血清, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的肝素抗凝, 制備抗凝血備用。

1.2.2 測定指標(biāo) 血液生化指標(biāo)17項(xiàng): 總蛋白(TP，g/L)、白蛋白(ALB, g/L)、總膽固醇(CHOL, mmol/L)、甘油三酯(TG, mmol/L)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLD,mmol/L)、尿素氮(BUN, mmol/L)、肌酐(CRE,mg/L)、尿酸(URIC, μmol/L)、總膽紅素(TBIL, μmol/L)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT, IU/L)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST, IU/L)、堿性磷酸酶(ALP, IU/L)、乳酸脫氫酶(LD, IU/L)、肌酸激酶(CK, IU/L)、淀粉酶(AMY,IU/L); 以及鎂(Mg, mmol/L)、葡萄糖(GLU, mmol/L)。

血液學(xué)指標(biāo)22項(xiàng): 白細(xì)胞(WBC, 109/L)數(shù)、淋巴細(xì)胞(LYM, 109/L)數(shù)、中性粒細(xì)胞(NEUT, 109/L)數(shù)、單核細(xì)胞(MON, 109/L)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS, 109/L)數(shù)、嗜堿性粒細(xì)胞(BAS, 109/L)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、單核細(xì)胞百分比(MON%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BAS%)、紅細(xì)胞(RBC, 1012/L)數(shù)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH, fmol)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW %)、血紅蛋白(HGB, g/L)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC, g/L)、紅細(xì)胞壓積(HCT, %)、紅細(xì)胞平均體積(MCV, g/L)、血小板(PLT, 109/L)數(shù)、血小板壓積(PCT, %)、血小板平均體積(MPV, g/L)、血小板體積分布寬度(PDW, %)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組均數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，之后進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清生化動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 血清蛋白的動(dòng)態(tài)變化 F11～20動(dòng)物的ALB趨勢平穩(wěn); TP的曲線在F13～14處于低點(diǎn), F15～16后平穩(wěn)(圖1)。多重比較F13～14與F15～16和F19～20之間差異極顯著(P＜0.01)。

圖 1 長爪沙鼠血清蛋白的動(dòng)態(tài)曲線Figure 1 The dynamic curves of serum proteins in gerbil

2.1.2 血清血脂的動(dòng)態(tài)變化 F11～20動(dòng)物的TG含量從F13～14后趨勢平穩(wěn); HDLD、CHOL含量F15后呈下降趨勢，多重比較HDLD的含量F13～14與F15～20差異顯著(P＜0.05); CHOL的含量F13～14與F15～16差異極顯著(P＜0.01)。HDLD、CHOL從F15～20后趨勢平穩(wěn)(圖2)。

圖 2 長爪沙鼠血清脂類的動(dòng)態(tài)曲線Figure 2 The dynamic curves of serum lipids in gerbil

2.1.3 血清代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化 F11～20長爪沙鼠的BUN、TBIL含量呈下降趨勢, URIC含量隨代數(shù)呈上升趨勢，F(xiàn)17后趨于平穩(wěn)，CRE含量趨勢平穩(wěn)。F11～14與F15～18差異顯著(P＜0.05)，BUN含量F17～18與F19～20差異顯著(P＜0.05)(圖3)。

2.1.4 血清酶的動(dòng)態(tài)變化 ALP、AST含量F11～20代趨勢平穩(wěn)；ALT含量趨勢略有上升; LD、CK、AMY含量的趨勢呈上升趨勢; ALT含量F17～18和F19～20代差異極顯著(P＜0.05); LD含量F17～18與F19～20差異極顯著(P＜0.01)。方差分析ALT、AMY 差異顯著(P＜0.05)(圖4)。

2.1.5 血清葡萄糖和鎂 F11～20動(dòng)物的GLU含量呈下降趨勢, Mg含量呈上升趨勢, MG含量F17～18與F19～20 差異顯著(P＜0.05)(圖5)。

圖 3 長爪沙鼠血清代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)曲線Figure 3 The dynamic curves of serum metabolites in gerbil

圖 4 長爪沙鼠血清酶的動(dòng)態(tài)曲線Figure 4 The dynamic curves of serum enzymes in gerbil

圖 5 長爪沙鼠血清葡萄糖和鎂動(dòng)態(tài)曲線Figure 5 The dynamic curves of serum glucose and magnesiumion in gerbil

2.2 血細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 白細(xì)胞及分類的動(dòng)態(tài)變化 F11～20代動(dòng)物的LYM指標(biāo)方差分析差異極顯著(P＜0.01)。WBC、EOS、EOS%、NEUT、NEUT%、MON、MON%、BAS、BAS%含量呈上升趨勢，白細(xì)胞分類含量和百分比的趨勢相同, LYM、LYM%呈下降趨勢。多重比較: WBC含量F13～14與F17～18差異顯著(P＜0.05); LYM、LYM%、MON%、NEUT%、EOS、EOS%、BAS、BAS%指標(biāo)F13～16與F17～20差異極顯著(P＜0.01); 所有指標(biāo)F17～18與F19～20均差異不顯著(表1)。

表 1 不同繁殖代數(shù)長爪沙鼠白細(xì)胞及分類指標(biāo)間比較Table 1 Comparison of white cells and classification indices between different reproductive algebras of gerbil

2.2.2 紅細(xì)胞及相關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化 近交系長爪沙鼠培育過程中RBC、HGB、MCH、RDW含量呈上升趨勢，HCT、MCV、MCHC呈現(xiàn)趨勢平穩(wěn)。多重比較: HGB、MCH含量F17～18與F19～20差異顯著(P＜0.05)(圖 6)。

2.2.3 血小板及相關(guān)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化 近交系培育過程中PLT、PCT、PDW含量F呈上升趨勢, MPV含量呈平穩(wěn)趨勢(圖7)。多重比較: PLT含量F11～16與F17～20差異極顯著(P＜0.01)，F(xiàn)17～18與F19～20 差異顯著(P＜0.05)(表2)。

圖 6 長爪沙鼠紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)動(dòng)態(tài)曲線Figure 6 The dynamic curves of red blood cell related indicators in gerbil

圖 7 長爪沙鼠血小板相關(guān)指標(biāo)動(dòng)態(tài)曲線Figure 7 The dynamic curves of platelets related indicators in gerbil

表 2 不同繁殖代數(shù)長爪沙鼠血小板指標(biāo)比較Table 2 Comparison of platelet indices between different reproductive algebras of gerbil

3 討論

血液生理生化指標(biāo)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重要的生物學(xué)特性指標(biāo)，其穩(wěn)定性和一致性是近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的主要特征之一。一般而言，當(dāng)動(dòng)物按近交系全同胞兄妹配對繁殖20代以后，其各項(xiàng)生物學(xué)特性指標(biāo)會十分接近。近交系的培育過程中，由于基因位點(diǎn)尚未完全純合，使近交系培育過程中不同代動(dòng)物的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)不盡一致，但各代之間哪些生理生化指標(biāo)趨于一致，哪些生理生化指標(biāo)不易穩(wěn)定一致尚未見報(bào)道。開展此項(xiàng)研究，不但可以從中了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系培育過程中應(yīng)注意比較哪些生理生化指標(biāo)的一致性和穩(wěn)定性，還可一定程度說明隨著近交繁殖代數(shù)的增加和基因位點(diǎn)的純合，其生理生化指標(biāo)也逐漸變化并趨于穩(wěn)定。

血液生理參數(shù)主要是動(dòng)物自身的遺傳因素與環(huán)境因素決定。遺傳因素是決定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液生理參數(shù)的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)，而環(huán)境因素則是決定血液生理參數(shù)變化的外在條件[4]。從實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果看，腦缺血模型長爪沙鼠近交系培育過程F11～F20的血細(xì)胞指標(biāo)方差分析LYM差異顯著，其它指標(biāo)均差異不顯著。WBC、EOS、EOS%、NEUT、NEUT%、MON、MON%、BAS、BAS%、PCT、PLT、HGB呈上升趨勢，白細(xì)胞分類含量和百分比的趨勢相同。HGB、MCH、PLT含量F17～18與F19～20差異顯著，其它指標(biāo)呈現(xiàn)F17～18和F19～20差異不顯著。結(jié)果表明近交系培育過程遺傳因素的變化會對血細(xì)胞產(chǎn)生影響，多數(shù)指標(biāo)F17代后平穩(wěn)趨勢體現(xiàn)近交系F20遺傳基因的穩(wěn)定性。

血液生化指標(biāo)17項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果從F11～20動(dòng)態(tài)曲線TP、TBIL、BUN、AMY、CK、ALT含量均趨于平穩(wěn)，而GLU、URIC、LD含量趨勢隨著代數(shù)上升而上升；MG、HDLD、CHOL含量趨勢隨著代數(shù)上升而下降。F11～20間的TBIL、ALT、AMY差異顯著(P＜0.05)。各項(xiàng)指標(biāo)在F11～20間進(jìn)行多重比較，血液生化指標(biāo)ALB、TG、CRE、ALP、AST差異不顯著，BUN、ALT、MG含量F17～18和F19～20代差異極顯著(P＜0.05); LD含量F17～18與F19～20差異極顯著(P＜0.01)，其它指標(biāo)F17后趨于平穩(wěn)。結(jié)果表明培育代數(shù)的差異對大多數(shù)生化指標(biāo)影響較大，指標(biāo)趨于平穩(wěn)體現(xiàn)了沙鼠在近交系培育過程中基因的純合。

血液生化和生理指標(biāo)在一定程度上能反映動(dòng)物的新陳代謝和生理機(jī)能狀況，是判斷健康動(dòng)物狀態(tài)和選擇合格動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn),是病理學(xué)、毒理學(xué)等研究的重要參考數(shù)據(jù)[5]。并且受諸多因素的影響, 其中以受遺傳基因控制為主,同時(shí)也受環(huán)境、年齡、代數(shù)差異及性別等因素的影響[6]。本研究應(yīng)用的動(dòng)物雖然是繁殖的種鼠，動(dòng)物的年齡偏大，對測試血液生理生化有一定的影響，但是每代動(dòng)物的性能基本一致。此研究描繪的腦缺血模型長爪沙鼠近交系培育過程動(dòng)態(tài)變化，對確定遺傳基因?qū)ρ荷砩笜?biāo)的影響，評價(jià)近交20代后遺傳基因的穩(wěn)定和生物學(xué)特性的一致性也是具有重要的參考價(jià)值。

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