長爪沙鼠肝臟基因組DNA甲基化水平檢測

王志遠, 劉月環(huán)

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 杭州 310013)

表觀遺傳學(xué)描述基因如何與周圍環(huán)境互作, 不改變DNA序列而基因表達發(fā)生可遺傳的改變，影響機體發(fā)育[1]。甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式, 是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體, 將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(5-mC)的反應(yīng)[2]。對人類及模型動物的研究表明, 高脂飲食誘導(dǎo)或藥物作用下，基因組及一些基因均可不同程度地發(fā)生甲基化的修飾[3-5]。作者課題組自2005年開始了長爪沙鼠高脂血癥的研究，建立了長爪沙鼠非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型[6]，該模型與人類疾病特征相似、病變有一定發(fā)展過程、形成時間短等優(yōu)勢[7]。長爪沙鼠NAFLD表型的原因并未弄清，因此引入表觀遺傳標(biāo)記篩選技術(shù)進行該性狀的深入研究，為全面地評價模型，或篩選出高效分子標(biāo)記，具有重要意義。本研究是，嘗試將5-mC的免疫學(xué)技術(shù)用于檢測沙鼠的肝臟基因組DNA整體甲基化水平，以評價各組間及各組內(nèi)部不同個體間甲基化水平的差異，為以后的NAFLD近交系培育打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及動物模型的建立

實驗用長爪沙鼠由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供并飼養(yǎng)[SCXK(浙)2014-0001]，其中新生雄性仔鼠6只(來自6個家系, 仔鼠組)，3月齡雄沙鼠12只(來自六個家系，體質(zhì)量50～70 g，每個家系各取1只分別作為青年對照組和青年模型組)，8月齡雄性鼠6只(來自6個家系，中老齡組)，體質(zhì)量80～100 g。青年模型組鼠經(jīng)高脂飼料飼喂4周造模。高脂飼料主要成份及配比如下: 商品化基礎(chǔ)料80.5%(各成份的配比及生產(chǎn)按照GB14924.3-2010執(zhí)行)、豬油7%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉10%。飼養(yǎng)于本中心[SYXK(浙)2014-0008]。

1.2 肝臟與血液樣品的采集

4周造模后，除仔鼠外，各組動物禁食禁飲12 h后，CO2麻醉，腹主動脈取血分離血清用于生化檢測, 取肝臟組織，分成2份，1份用于制作病理切片檢查脂肪肝形態(tài)學(xué)，另一份貯存于-80 ℃用于檢測肝臟基因組DNA整體甲基化水平。仔鼠組采用剪頭取肝臟，方法同成年動物，但由于血量較少，未收集。

1.3 HE染色與血清四項生化指標(biāo)的檢測

取各組長爪沙鼠肝臟大葉相同部位一片，制作切片并做組織形態(tài)學(xué)觀察，總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)等測試試劑盒由上海申能-德賽診斷技術(shù)有限公司提供，用意大利產(chǎn)AUTOLAB PM4000型生化分析儀測得。

1.4 甲基化檢測

采用Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ultra Kit(總體DNA甲基化極易定量檢測試劑盒)(比色法)(美國Epigentek公司)，其原理是基因組DNA提取后經(jīng)過檢測純度、濃度均為合格的樣品用移液器加入96孔板后會被固定在這種高親和性的微孔板上，甲基化的片段會被捕獲抗體(Capture Antibody, 即二抗1)以及檢測抗體(Detection Antibody, 二抗2，即酶標(biāo)的能與二抗1結(jié)合的抗體)識別，然后使用酶標(biāo)儀檢測 450 nm 處的吸光度(A)值，甲基化DNA的量同測量的A值成正比，利用這種原理對其進行比色法定量。肝臟基因組DNA用DNA提取試劑盒提取，純度為A260/A280值落在1.8～2.0, 間接ELISA法加樣量為100 ng, 操作步驟見試劑盒說明書，過程同普通定量ELISA法試劑盒(將陽性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成終濃度分別為0.5 ng/μL、1.0 ng/μL、2.0 ng/μL、5.0 ng/μL 及 10 ng/μL 五管標(biāo)準(zhǔn)樣品, 加入相應(yīng)的孔位，測出A值后用線性回歸法做成標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將樣品A值代入方程來算出樣品中的甲基化水平相對量)，公式如下:5-mC%

其中S為上樣量(ng)，P為陽性對照的絕對含量(ng)。由于作標(biāo)準(zhǔn)曲線時陽性對照中只有50%的5-mC，因此乘以2是得到陽性對照中全部5-mC的含量，分母中括號部分是一個陽性樣的標(biāo)準(zhǔn)化。實驗過程如下: 試劑盒室溫平衡→加入做標(biāo)準(zhǔn)曲線的五管標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照及稀釋好的各待檢樣品→混勻后孵育→洗滌→二抗1，孵育→洗滌→二抗2，孵育→顯色→終止→讀取A值→生成標(biāo)準(zhǔn)曲線→計算各待檢樣品的相對含量。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下可見仔鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)清楚、肝細胞索呈板狀排列整齊，肝血竇中存在髓外造血灶的造血細胞的遺存，因此在肝血竇中可見大量成堆分布有單核細胞和成堆的紅細胞(圖1A), 青年組沙鼠(正常鼠)腹壁無明顯的脂肪沉積, 肝臟外觀色紅、邊緣銳利、無明顯異常改變，小葉清晰、肝細胞索呈板狀排列(圖1B)，模型組及老齡組肝臟外觀色黃、邊緣較鈍、觸之油膩(圖1C、D)，部分還存在脾臟腫大，HE染色結(jié)果提示肝臟可見較為明顯的的脂肪變性。

2.2 血液生化

與青年對照組、中老齡組相比較,青年模型組造模4周時 TC迅速升高7倍多，HDL、LDL也有顯著上升(表1)。中老齡組TG升高較大，與其他組相比有極顯著差異(P＜0.01)。因仔鼠血液太少，沒有檢測。

2.3 肝臟基因組DNA甲基化水平

肝臟基因組DNA整體甲基化檢測結(jié)果表明, 新生仔鼠肝臟基因組DNA甲基化水平為2.383±0.856,僅次于高脂飼料誘導(dǎo)的青年模型組沙鼠(3.775±1.515)(P＜0.01), 但高于中老齡沙鼠(1.758±1.366)(P＜0.01),相對于青年對照組(0.492±0.332)有極顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

圖 1 各組動物肝組織的形態(tài)學(xué)圖 (HE×20)Figure 1 Pathology of liver in each group (HE staining×20)

表 1 不同年齡沙鼠4項血液生化指標(biāo)Table 1 The four serum lipid indexes of different groups mmol/L

本文采用間接ELISA法檢測沙鼠肝臟基因DNA甲基化水平。該方法相較于其他檢測整體甲基化的方法如熒光定量PCR、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(HPCE)等，具有簡便、迅速、通量高、對儀器要求不嚴(yán)格、易于標(biāo)準(zhǔn)化等特點，在大規(guī)模檢測篩選中可能具有較強優(yōu)勢。

本研究表明，青年模型組鼠及中老齡組沙鼠均出現(xiàn)高脂血癥，肝臟出現(xiàn)較為明顯的脂肪變性，而肝臟基因組DNA整體甲基化水平由高到低分別是高脂飼料誘導(dǎo)的青年模型組鼠＞新生仔鼠＞中老齡鼠＞青年對照組鼠。新生仔鼠肝臟基因組DNA整體甲基化水平相對高，這可能與胚胎期的重編程及環(huán)境因素有密切關(guān)系[8,9]。目前有研究[10]認為NAFLD漸進式發(fā)展的病理改變(脂肪肝-纖維化-NASH)是與肝臟基因組甲基化改變密切相關(guān)，即體內(nèi)的甲基供體逐漸減少而致的蛋氨酸循環(huán)紊亂有關(guān)，也有研究[11]認為體內(nèi)甲基供體、甲基轉(zhuǎn)移酶以及其他調(diào)節(jié)甲基化的因素(例如甲基供體與甲基消耗體的動態(tài)平衡)共同影響高脂血癥與脂肪肝的發(fā)生。另外，DNA甲基化的改變不僅具有時間累積效應(yīng)，而且受飲食習(xí)慣、體質(zhì)量、衰老及環(huán)境等的影響[12,13]。由于甲基化在一定范圍內(nèi)是一個動態(tài)變化過程[14]，因此，調(diào)整外部條件或可致疾病逆轉(zhuǎn)。由此推測，中老齡沙鼠的脂肪肝或許與DNA甲基化的時間累積效應(yīng)及衰老等因素有關(guān)，青年模型組在檢測時點上甲基化水平高于對照組，且存在個體間差異，這或許與沙鼠個體內(nèi)甲基供給與甲基消耗體間平衡有關(guān)，去除高脂飲食的脂肪肝癥狀是可以改善, 因此臨床上將脂肪肝視為一種良性的NAFLD。

動物遺傳研究表明，CpG島(基因組中長度為300～3000 bp的富含CpG二核苷酸的一些區(qū)域）的甲基化DNA濃度、基因啟動子區(qū)域甲基化位點數(shù)量及頻率與動物特定的性狀密切相關(guān)，是一種潛在的分子標(biāo)記[15]。由于甲基化(基因表達水平、甲基化位點數(shù)量及頻率)是可以遺傳的，提示其可作為實驗動物特定疾病性狀的早期選育標(biāo)記[16,17]。鑒于長爪沙鼠對高脂飼料的易感性及封閉群中存在以年齡段為主的血脂差別性狀，結(jié)合本次檢測結(jié)果，顯示沙鼠的肝臟基因組DNA整體甲基化水平受高脂飲食及年齡的影響。

[1] Wu CT, Morris JR. Genes, genetics, and epigenetics: a correspondence[J]. Science, 2001, 293(5532):1103-1105.

[2] Reik W, Dean W, Walter J. Epigentic reprogramming in mammalian development[J]. Science, 2001, 293(5532):1089-1093.

[3] de Mello VD, Matte A, Perfilyev A, et al. Human liver epigenetic alterations in non-alcoholic steatohepatitis are related to insulin action[J]. Epigenetics, 2017, 12(4):287-295.

[4] Gallego-Dur n R, Romero-Gómez M.Epigenetic mechanisms in non-alcoholic fatty liver disease: An emerging field[J].World J Hepatol, 2015, 7(24):2497-2502.

[5] Lee J, Kim Y, Friso S, et al. Epigenetics in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Mol Aspects Med, 2017, 54(1):78-88.

[6] 徐黎明, 石巧娟, 徐磊, 等. 蒙古沙鼠非酒精性脂肪性肝病模型的建立與評價[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2007, 19(11):1-2,7.

[7] 劉月環(huán), 吳舊生, 應(yīng)華忠, 等. 長爪沙鼠NAFLD模型的建立及其遺傳學(xué)的研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 27(5):9-11.

[8] Miki H, Inoue K, Kohda T, et al. Birth of mice produced by germ cell nuclear transfer[J]. Genesis, 2005, 41(2):81-86.

[9] Novakovic B, Ryan J, Pereira N, et al. Postnatal stability,tissue, and time specific effects of AHRR methylation change in response to maternal smoking in pregnancy[J]. Epigenetics,2014, 9(3):377-386.

[10] 朱惠蓮. 甲基供體與非酒精性脂肪肝關(guān)聯(lián)性研究及其對脂代謝調(diào)節(jié)基因甲基化影響的機制探討[C]. 合肥: 膳食纖維與健康—達能營養(yǎng)中心第十七屆學(xué)術(shù)年會論文集,2014.

[11] 李達. 煙酰胺與代謝綜合征關(guān)系的研究[D]. 沈陽: 中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文, 2013.

[12] Jiang MH, Fei J, Lan MS, et a1. Hypermethylation of hepatic Gck pro. Diabetologia, 2008, 51(8):1525-1533.

[13] Cordero P, Campion J, Milagro FI, et al. Dietary supplementation with methyl donor groups could prevent nonalcoholic fatty liver. Hepatology, 2011, 53(6):2151-2152.

[14] Hao W, Yi Z. Reversing DNA methylation: mechanisms,genomics, and biological functions[J]. Cell, 2014, 156(1-2):45-68.

[15] 陳琦, 趙靜, 張立嶺, 等. 多脊椎蒙古羊 Hoxc8 exon-1 甲基化分析[J]. 中國畜牧雜志, 2009, 45(23):10-14.

[16] Jiang L, Zhang J, Wang JJ, et al. Sperm, but not oocyte, DNA methylome is inherited by zebrafish early embryos[J]. Cell,2013, 153(4):773-784.

[17] Li YY. Genetic and epigenetic variants influencing the development of nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2012, 18(45):6546-6551.