嗜腸型小鼠肝炎病毒RT-PCR診斷方法的建立及其應(yīng)用

艾東旭, 孫 菲, 李 鈺, 法云智, 孫兆增, 李蓮瑞

(1. 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 阿拉爾 843300;2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心, 北京 100071;3. 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 阿拉爾 843300)

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬(Corona virus)，是一單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈圓形或多形態(tài)，外有囊膜，囊膜表面有特征性的花冠狀突起[1]; 是實驗小鼠病原微生物感染中最常見的一種病毒[2]。一般情況下，大多數(shù)攜帶病毒小鼠在鼠群中呈潛伏性感染，對小鼠具有高度傳染性，并直接影響實驗結(jié)果的準確性和可靠性[3,4]，對工作人員的健康也會造成一定危害。國家也規(guī)定MHV為清潔級小鼠和SPF小鼠必須檢測的病原體之一且需要排除[5]，因此, 及時、有效地檢測出MHV, 對實驗動物質(zhì)量控制和保證實驗結(jié)果準確可靠具有非常重要意義。

目前對MHV的的檢測主要是對針對抗體的檢測，比如ELISA方法[6]，但針對抗體檢測，具有一定的滯后性，并且不能對不同組織型的MHV進行特異性診斷。因此本研究擬探索利用RT-PCR的方法對MHV進行檢測，希望建立更加快速而準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用的MHV陽性組織，為中心實驗室之前檢測小鼠MHV陽性病料液氮凍存樣品，ELISA檢測抗原結(jié)果為陽性。實驗用的陰性對照為現(xiàn)有飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠(經(jīng)檢測小鼠MHV抗原結(jié)果為陰性)[SCXK(軍)2012-0004]。

1.2 主要試劑、儀器

Trizol購自康為世紀生物科技有限公司; LA Taq酶、dNTP Mix購自TaKaRa代理商(北京六通經(jīng)貿(mào)有限公司); AMV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自NEB代理商(北京百奧康生物技術(shù)有限公司)等。電子天平(ME204)，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物合成 根據(jù)文獻報道及查閱資料，針對嗜腸型MHV的M蛋白設(shè)計引物1(特異性反轉(zhuǎn)錄引物)及引物2～5(4對特異性擴增引物)(表1)，并由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 小鼠組織總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 提取RNA時所用手術(shù)器械、勻漿器經(jīng)180 ℃干烤3 h; 離心管, 移液槍頭等均經(jīng)無RNA酶處理。取凍存的結(jié)腸組織于勻漿器中加入Trizol充分碾磨均勻后, 移到1.5 mL的離心管中靜置15 min。按照Trizol法說明書提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)電泳檢測后, 立即使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄, 合成第一鏈cDNA。選一只現(xiàn)有飼養(yǎng)的8周齡小鼠, 斷頸處死, 利用同樣的方法提取結(jié)腸組織總RNA并合成第一鏈cDNA。

表 1 引物序列

1.3.3 PCR反應(yīng)體系 以合成的第一鏈cDNA為模版進行PCR擴增。反應(yīng)體系為: 緩沖液2.5 μL，LA Taq酶0.125 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模版1 μL，ddH2O 15.375 μL，25 μL總體系進行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s, 72 ℃ 2 min, 72 ℃ 5 min, 4 ℃永久, 35 個循環(huán)結(jié)束反應(yīng)。

反應(yīng)產(chǎn)物取5 μL經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳后, 在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。將擴增出目的條帶的產(chǎn)物進行切膠回收，與pMD18-T載體相連；轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂氨芐抗性LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落搖菌并做PCR鑒定，將陽性菌液送北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。

1.3.4 引物的篩選與退火溫度的選定 在其他PCR反應(yīng)體系、條件不改變的情況下，對所設(shè)計的引物進行退火溫度的摸索。根據(jù)引物合成單上的Tm值及文獻報道中的退火溫度，設(shè)計退火溫度梯度，由條帶的特異性，選擇確定最適溫度。當(dāng)各引物最適溫度確定后，各引物進行相同條件下PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

以合成的第一鏈cDNA為模版進行PCR擴增，用相同的模版、體系，在各自引物最適溫度下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，取相同量的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.5 敏感性試驗與特異性試驗 將模版與水按照1∶1，1∶4，1∶9進行稀釋，在其他PCR反應(yīng)體系、條件不改變的情況下，進行PCR擴增，將擴增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳, 在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、分析結(jié)果。以中心實驗室之前檢測小鼠肝炎陽性的病料所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為陽性對照模版，以現(xiàn)飼養(yǎng)小鼠為實驗動物，以及仙臺病毒和肺炎病毒模版用引物2, 3進行PCR擴增。

2 結(jié)果

2.1 小鼠組織總RNA的提取結(jié)果

將提取的小鼠結(jié)腸組織總RNA經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)拍照。如圖1所示，可以清晰的看到28 s, 18 s, 和5 s三條帶,說明提取的RNA較為完整。

2.2 引物篩選

引物2～5經(jīng)過梯度PCR擴增及質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，可以確定引物2和引物3的最適退火溫度為60 ℃，引物4和引物5的最適退火溫度分別為59 ℃和58 ℃。

引物2, 3, 4, 5的擴增片段如圖2。引物2和引物3具有一定的特異性，且亮度差異不大，與引物4和5相比, 條帶較亮，擴增結(jié)果也較為明顯，所以選引物2和3繼續(xù)實驗，舍棄引物4和5。引物2的分子量為393 bp，引物3的分子量為575 bp。

圖 1 腸組織RNA

2.3 測序結(jié)果

采用PCR擴增對陽性克隆菌進行篩選(圖3)并送檢測序。測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)已登錄的序列(GenBank: D11129.1)進行比對分析后，可以確定為MHV。

2.4 敏感性與特異性試驗結(jié)果

圖 2 引物2、3、4、5 PCR擴增

引物2，3在模版cDNA和水按1∶1, 1∶4，1∶9稀釋后, PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳后分析如圖4, 可以看出在模版和水1∶9稀釋后條帶已不清晰, 不能用來做檢測。如圖5所示, 實驗組用引物2, 3進行擴增時僅中心實驗室之前檢測小鼠肝炎陽性的病料擴增出目的條帶, 相同條件下,現(xiàn)飼養(yǎng)的小鼠、小鼠仙臺病毒以及小鼠肺炎病毒并沒有擴增出目的條帶, 說明引物2和3具有一定的特異性。

圖 3 引物2和3克隆菌陽性菌鑒定

圖 4 敏感性試驗

圖 5 特異性試驗

3 討論

MHV主要經(jīng)空氣和接觸傳播，沒有明顯的季節(jié)性，分布于世界各地。通常, 感染小鼠呈隱性，在不受特殊刺激情況下不會激發(fā); 而在某些應(yīng)激情況下會導(dǎo)致其發(fā)病，表現(xiàn)為致死性肝炎, 腸炎等[7,8]。因患病小鼠的糞便、鼻咽滲出物、甚至尿液中都含有大量的病毒，所以健康小鼠會通過許多(飲水用具、墊料，周圍環(huán)境等)途徑感染該病毒[8]。

實驗動物感染MHV非常普遍, 根據(jù)MHV嗜組織特性的不一樣, 分為嗜腸株(enterotropic MHV strain)和呼吸株(respiratory MHV strain), 與呼吸型的MHV相比，嗜腸型MHV在臨床上一般呈隱性感染較多[9]。賴國旗等[2]對MHVRT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用進行了初步探索, 然而在實際試驗中, 由于每個實驗室所針對不同基因型檢測和所設(shè)計引物序列、引物敏感型的差異, 取樣組織的差異, 以及擴增程序的不同, 在建立MHVR T-PCR檢測方法上也存在一定的差異。本研究主要針對嗜腸型MHV的M蛋白設(shè)計引物, M 蛋白的序列相對保守。實驗結(jié)果表明，本實驗建立的RT-PCR診斷及檢測方法與常用的ELISA檢測小鼠MHV抗原的方法結(jié)果相符。這種檢測方法可以用于嗜腸型MHV的快速檢測。

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