單核苷酸多態(tài)性位點法對國內(nèi)近交系小鼠遺傳檢測

李銀銀, 陳振文, 劉麗均, 李長龍, 劉 欣, 呂建祎, 郭 萌, 杜小燕

(首都醫(yī)科大學1. 實驗動物部; 2. 基礎醫(yī)學院, 北京 100069;3. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司, 上海 201615)

近交系小鼠是最先用近交方式繁育成功的實驗動物，由于其具有品系內(nèi)遺傳組成相似度極高、基因純合、生物特性均一、表型特征顯著等特征，在生物醫(yī)學研究各個領域中廣泛應用[1]。但是，由于近交系小鼠品系繁多，在Mouse Genome Informatics (MGI)中就有幾千種包括基因修飾在內(nèi)的近交系小鼠品系，常用的近交系品系也有幾十種。要保持每個品系的遺傳組成穩(wěn)定及其特有的表型特征恒定不變并非易事，并且近交系小鼠受環(huán)境、飼養(yǎng)方式、引種等的影響，會發(fā)生遺傳污染和突變，導致其相應遺傳組成發(fā)生改變，從而成為新的亞系。因此，建立一套遺傳檢測體系定期對其遺傳質(zhì)量進行檢測十分重要[2]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是近年來出現(xiàn)的第三代遺傳標記，具有數(shù)目多、分布廣、遍布整個基因組及穩(wěn)定遺傳的特點，因此能對小鼠遺傳狀況進行描述[2]。國內(nèi)外有多名研究者[2-4]用SNP進行過近交系小鼠的遺傳檢測。本實驗在國內(nèi)外文獻中挑選了分布于小鼠全部染色體上的95個SNP位點[3,4]，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDITOF-MS)技術對來自國內(nèi)各地36個不同群體來源的近交系小鼠進行遺傳檢測，以期在一定程度完善SNP遺傳標記應用于近交系小鼠遺傳質(zhì)量分析。

1 材料與方法

1.1 樣本材料

選取國內(nèi)較常用的近交系小鼠和部分基因修飾小鼠共29個品系36個群體，包括不同群體來源的同一近交系小鼠，分別來自國內(nèi)5個地區(qū)，均為清潔級或SPF級。樣品來源、編號、品系名稱等信息見表1。每個群體6只動物。本實驗已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學動物實驗及實驗動物福利委員會審核(AEEI-2016-187)。

1.2 小鼠基因組DNA的制備

取上述36個群體共216只動物的肝臟組織或者鼠尾0.1 g，用酚-氯仿法提取組織DNA[5]，經(jīng)Nanodrop 2000C微量分光光度計檢測吸光度A260/A280比值在1.8～2.0，瓊脂糖電泳檢測樣品合格。取DNA原液適量稀釋成50～100 ng/μL作為DNA模版，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP位點的選擇

本研究所用95個SNP位點從相關文獻中選取[3,4], 位點選擇分布于小鼠1～20號染色體上, 其中50個SNP位于基因內(nèi)，較大范圍覆蓋小鼠基因組。

1.4 MALDI-TOF-MS技術SNP位點基因分型[6]

1.4.1 PCR擴增反應 根據(jù)SNP位點的序列信息，使用Sequenom引物設計軟件Assay design3.1設計PCR反應和單堿基擴展引物，合成引物后進行PCR擴增，其體系如下: 模板DNA 1 μL，上下游引物(500 nmol/L)各 1 μL, dNTP Mix (25 mmol/L) 0.1 μL,HotStar Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL，MgCl2(25 mmol/L) 0.325 μL, PCR Buffer (1.25×) 0.625 μL和ddH2O 1.85 μL。擴增條件為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性 20 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)45次; 最后72 ℃延長3 min。

1.4.2 產(chǎn)物堿性磷酸酶(SAP)處理反應 按照0.3 μL SAP(1 U/μL)，10 ×的SAP Buffer 0.17 μL和雙重蒸餾水 1.53 μL混合，將反應混合物加入到PCR產(chǎn)物中進行反應, 程序為: 37 ℃保溫20 min, 85 ℃保溫5min。

1.4.3 單堿基延伸反應 將多重PCR反應混合物加入上一步反應產(chǎn)物中。iPLEX反應體系為iPLEX酶0.041 μL, iPLEX Buffer Plus 0.2 μL, 引物混合液 0.94 μL,iPLEX終止混合液0.2 μL和雙重蒸餾水0.619 μL。設置延伸反應程序: 94 ℃預變性30 s; 94 ℃變性5 s, 52℃退火5 s, 80 ℃延伸5 s內(nèi)部循環(huán)5個，持續(xù)外部循環(huán)40個。最后72 ℃延伸3 min。

1.4.4 MALDI-TOF-MS檢測 PCR反應完成后向產(chǎn)物384孔板中加入16 μL三重蒸餾水, 室溫旋轉(zhuǎn)混勻30 min, 經(jīng)樹脂純化后的延伸產(chǎn)物點在樣品靶上,MALDI-TOF-MS分析, 檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件獲取, 根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本各位點基因分型。

2 結(jié)果

2.1 36個小鼠群體的基因分型

本實驗共進行了95個SNP位點×36個群體基因分型，結(jié)果見表1。其中成功分型的達到96.46%(3 299/3 420), 沒有分型成功的集中在3個群體, 占分型失敗樣品的96.69%(117/121)。全部95個位點均分型成功的群體為29個(80.56%)。在群體間95個位點都呈現(xiàn)了多態(tài)性，即沒有一個位點在36個群體全部為同一基因型。95個位點的基因分型結(jié)果顯示，36個群體內(nèi)大部分位點為單態(tài)，包括純合單態(tài)性(即全部樣品的等位基因為純合且基因型相同)和雜合單態(tài)性(即全部樣品的等位基因為雜合但基因型相同)。但每個群體中均有位點呈現(xiàn)多態(tài)性，包括雜合多態(tài)性(即群體內(nèi)有個別樣品呈現(xiàn)雜合基因型)或純合多態(tài)性(即群體內(nèi)6只動物均為純合但有個體與其他動物基因型不同)。單態(tài)性位點比例超過90%的群體有21個(58.33%)，比例最高的群體為廣州3的C3H和北京4來源的C57BL/6N，達到98.95%，只有一個位點是多態(tài)性的。

2.2 群體間基因型差異比較結(jié)果

根據(jù)用95個SNP位點基因分型的結(jié)果對36個群體進行兩兩比較，每兩個群體之間基因型不同的位點數(shù)見表2。從表中可以看出，在36個近交群體相互比較，等位基因型不同的位點數(shù)最多達到58個, 是SAMP8品系和EYFP-C57BL/6J以及SAMP8品系和C57BL/6J SH; 最少也有1個位點的差別，主要集中在不同單位來源的C57BL/6J、C57BL/6J背景的基因修飾動物、C57BL/6N和C57BL/10J之間，例如C57BL/6J SH與A2A-1-B6J和C57BL/6J G2、C57BL/10J G3和C57BL/10J NJ、A2A-1-B6J與EGFP-B6J和C57BL/6J G2等均有一個位點等位基因型不同。

表 1 29個小鼠近交品系樣品群體來源信息及95個SNP基因分型結(jié)果Table 1 The sources, numbers, names and analysis of the results of 36 inbred strains genotyped by 95 SNPs

3 討論

目前國家實驗動物遺傳標準中對小鼠近交系的檢測方法仍然是生化標記法，該方法需要處死動物采集組織才能進行, 實驗程序較為復雜。因此，采用分子遺傳標記檢測小鼠遺傳狀況勢在必行。國內(nèi)外學者[7-9]用第二代分子遺傳標記微衛(wèi)星位點對近交系小鼠進行了研究。SNP作為第三代遺傳標記物在小鼠近交系遺傳研究中也已經(jīng)得到應用[10]。國外對SNP檢測近交系小鼠報道位點最多和品系最多的是Petkov 等[4]篩選到28個位點對常用的48種近交系和近300種遺傳修飾小鼠品系進行了基因分型。國內(nèi)有多位研究者[10,11]采用SNP對常用近交系小鼠的遺傳質(zhì)量狀況進行了分析，表明SNP可用于小鼠遺傳檢測。本實驗選95個覆蓋小鼠所有染色體的SNP位點[3,4]，對國內(nèi)最廣泛應用的近交系小鼠品系和部分基因修飾近交系小鼠進行了遺傳檢測。與國內(nèi)已有研究報道相比, 本實驗所選的SNP位點數(shù)和受檢品系數(shù)量均比較多。

MALDI-TOF-MS技術具有分析速度快、準確率分辨率高、高通量低成本等特點，是一種理想的SNP檢測方法[12]。本文研究也證明，該方法可以比較可靠快速地進行大量樣品的基因分型。本實驗共進行了2萬多次快速的基因分型，成功率達96%以上，有3個品系的樣品可能因為DNA樣品長途運送和長期保存后質(zhì)量下降，導致有多個位點沒有分型成功。在被檢群體中，一半多群體內(nèi)單態(tài)性位點超過了90%，但也有個別群體作為近交系而言遺傳質(zhì)量不佳，應引起注意。從位點角度分析，有些位點在群體內(nèi)的多態(tài)性發(fā)生頻率較高，如45號位點在28種群體中均呈現(xiàn)雜合多態(tài)性，這樣的位點可能本身屬于不易純合的位點，這種雜合多態(tài)性可能并不是近交系本身突變或發(fā)生遺傳污染造成的。另外有些位點在多種群體中均未檢出，可能是這些位點處在DNA容易斷裂的位置，對DNA樣品的完整性要求更高；也可能這些品系群體本身不存在這些位點。另外，TA2和DBA/1(北京3)在多個位點上是多態(tài)的，且這兩個品系中都是同一只動物出現(xiàn)多態(tài)等位基因型，表明這品系內(nèi)該動物可能發(fā)生了遺傳突變或基因污染。因此，我們還需要進一步對這些SNP位點進行凝練，篩選出更適合近交系小鼠遺傳檢測的SNP位點組合。

從理論上講, 近交系品系間多態(tài)性越好的位點越適合進行品系鑒定，從表2結(jié)果也可以看出，用這95個位點可以對36個群體進行鑒別，群體兩兩比較等位基因型差異位點數(shù)最多可達58個。即使是同一品系不同群體來源，如C57BL/6J，不同來源也會有1～5個位點的等位基因不同，但這并不能說這些品系就不是C57BL/6J。因此，有必要像犬的品種鑒定一樣[13]，篩選適合不同小鼠品系特征的SNP位點組合進行品系鑒定。另一個出乎意料的結(jié)果是，基因修飾動物與背景動物基因型有多個SNP位點基因型不同，這既說明用這些位點可以對基因修飾動物與背景動物進行鑒別,也可能是基因修飾作用引起了背景動物SNP位點的突變，導致二者產(chǎn)生很大差異。我們之前的研究[14,15]已經(jīng)證明基因修飾會導致微衛(wèi)星發(fā)生突變,引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性出現(xiàn)。最近Nature Methods雜志報道[16]基因修飾技術會導致小鼠基因組大量的SNP發(fā)生突變，本研究證明轉(zhuǎn)基因也可能導致SNP發(fā)生突變。

綜上所述，本研究所選取的95個位點可參考用于國內(nèi)常用和基因修飾近交系小鼠的遺傳檢測，也可針對多個品系進行品系鑒定。

[1] 劉先菊, 王艷榮. 常用近交系小鼠微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的分析研究[J]. 實驗動物科學, 2010, 27(5):1-4.

[2] 趙麗亞, 張蓉, 趙瑩, 等. 單核苷酸多態(tài)性(SNP)在近交系小鼠遺傳檢測中的應用[J]. 實驗動物與比較醫(yī)學, 2016, 36(1):24-31.

[3] 謝雯, 鮑世民, 謝建云, 等. 基于PCR-LDR平臺的近交系小鼠遺傳質(zhì)量快速檢測方法[J]. 中國實驗動物學報, 2012,20(4):1-8.

[4] Petkov PM, Cassell MA, Sargent EE, et al. Development of a SNP genotyping panel for genetic monitoring of the laboratory mouse[J]. Genomics, 2004, 83(5):902-911.

[5] Zhang S, Huo X, Li Z, et al. Microsatellite instability detected in tumor-related genes in C57BL/6J mice with thymic lymphoma induced by N-methyl-N-nitrosourea[J]. Mutat Res,2015, 782:7-16.

[6] 葉阿里, 張海燕, 竇亞玲, 等. 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術檢測藥物代謝酶基因多態(tài)性平臺的建立[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志, 2016, 31(5):30-33.

[7] 歐陽兆和, 陳振文. 微衛(wèi)星DNA多態(tài)性在十種近交系小鼠遺傳監(jiān)測中的應用研究[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2004,14(2):71-74.

[8] 吳寶金, 茅慧華, 朱紅, 等. 小鼠 39 個微衛(wèi)星的 PCR 條件及其運用[J]. 中國實驗動物學報, 2003, 11(4):216-220.

[9] 謝建云, 邵偉娟, 胡建華, 等. 微衛(wèi)星技術對近交系小鼠遺傳質(zhì)量的分析[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2007, 17(9):511-515.

[10] 胡培麗, 范昌發(fā), 岳秉飛, 等. 單管雙向等位基因?qū)Ｒ恍詳U增方法在近交系小鼠遺傳檢測中的應用[J]. 中國實驗動物學報, 2006, 14(4):246-250.

[11] 崔淑芳, 翟秀華, 韓士忠, 等. 雙色熒光雜交芯片在近交系小鼠遠程監(jiān)測中的應用[J]. 動物學研究, 2008，29(1):10-16.

[12] 楊何義, 蔡耘, 王杰, 等. 生物質(zhì)譜作為SNP分型檢測方法的研究[J]. 質(zhì)譜學報, 2003, 24(4):449-455.

[13] 薛政. 用微衛(wèi)星方法進行犬種鑒定[D]. 上海: 上海交通大學, 2012.

[14] Zuo B, Du X, Zhao J, et al. Analysis of microsatellite polymorphism in inbred knock-out mice[J]. PLoS One, 2012,7(4):1-7.

[15] Huo X, Du Y, Lu J, et al. Analysis of microsatellite instability in CRISPR/Cas9 editing mice[J]. Mutat Res, 2017, 797-799:1-6.

[16] Schaefer KA, Wu WH, Colgan DF, et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo[J]. Nature Methods,2017, 14 (6):547-548.