應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)兩個(gè)SD大鼠封閉群的遺傳分析

洪 楊, 袁明銘, 周 靜, 張 磊, 董 涵

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院, 成都 610041)

SD大鼠是常用的封閉群實(shí)驗(yàn)大鼠，在科研、檢定和教學(xué)等領(lǐng)域被廣泛使用。作為封閉群動(dòng)物，是以非近親交配方式繁殖，具有個(gè)體遺傳多態(tài)性和群體遺傳一致性的特點(diǎn)。遺傳多態(tài)性是指群體基因型的多態(tài)性，個(gè)體間的雜合性。遺傳一致性則指整個(gè)封閉群動(dòng)物的基因頻率保持穩(wěn)定[1]，在封閉群動(dòng)物繁育過(guò)程中，要盡量保證動(dòng)物隨機(jī)交配并減少破壞遺傳平衡的因素，從而使不同地區(qū)同一品種的動(dòng)物遺傳上保持一致。封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳多態(tài)性和遺傳一致性是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性和一致性的重要條件。目前，全國(guó)各地SD大鼠各自封閉繁育，長(zhǎng)此以往可能導(dǎo)致群體間的遺傳分離，因此，有必要定期對(duì)SD大鼠進(jìn)行遺傳監(jiān)測(cè)。

對(duì)封閉群動(dòng)物，目前還缺乏統(tǒng)一的遺傳檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法。通常遺傳質(zhì)量檢測(cè)是依靠遺傳標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行。傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記物有形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記。傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記物主要是對(duì)基因表型的標(biāo)記，不能反映遺傳本質(zhì)的差異和變化，且存在數(shù)量少、多態(tài)性不豐富等缺點(diǎn)，因此其應(yīng)用范圍受到很大限制[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多學(xué)者利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測(cè)，該方法能直觀地反映生物遺傳本質(zhì)的變化。常用的分子遺傳標(biāo)記包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、微衛(wèi)星DNA、單核苷酸多態(tài)性等，其中微衛(wèi)星DNA應(yīng)用廣泛[2]。微衛(wèi)星DNA又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)，是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸為單位、多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，具有分布廣、數(shù)量大、保守性強(qiáng)、多態(tài)信息含量高等特點(diǎn)[3]，被認(rèn)為是遺傳相關(guān)研究的最主要分子標(biāo)記之一。本試驗(yàn)利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)北京和上海兩個(gè)單位SD大鼠封閉群的遺傳多樣性并分析兩群體間的遺傳關(guān)系，以期獲得這兩個(gè)SD大鼠封閉群的遺傳概貌信息，并從分子遺傳角度對(duì)其現(xiàn)有繁育方式作出評(píng)價(jià)，同時(shí)為SD大鼠遺傳檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)自北京[SCXK(京)2012-0001]和上海 [SCXK(滬)2012-0002] 兩個(gè)單位6周齡SPF級(jí)SD大鼠各30只，雌雄各半，體質(zhì)量150～160 g。大鼠經(jīng)脫頸法處死后取肝臟組織，-20 ℃保存?zhèn)溆?。所有?dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道關(guān)懷。本研究所有實(shí)驗(yàn)均在四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(川)2013-100]。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒, 為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品; Prime STAR HS (Premix), 購(gòu)自日本Takara公司; Separation Buffer、Size Marker、Alignment Marker均由美國(guó)Bioptic公司提供。

1.3 引物選擇

選擇多態(tài)性好的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(R43、R63、R88、R103、R132、R142、R159)進(jìn)行試驗(yàn)[4]，各微衛(wèi)星位點(diǎn)詳情見(jiàn)表1。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表 1 7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列Table 1 Primer sequences of 7 microsatellite loci

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA提取 取大鼠新鮮肝臟組織50 mg,利用組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，以DNA提取試劑盒進(jìn)行組織DNA提取，利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，將符合PCR模板濃度要求的基因組置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25 μL, 2×Prime STAR HS (Premix) 12.5 μL; 上游引物(1 μmol/L)2.5 μL; 下游引物 (1 μmol/L) 2.5 μL; 模板(500 ng/μL)1.0 μL; ddH2O 6.5 μL。PCR 反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性3 min; 94 ℃變性 1 min, 退火 1 min, 72 ℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸3 min。利用Qsep100全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Q-Analyzer軟件讀取等位基因片段大小，通過(guò)PopGene1.32軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、群內(nèi)近交系數(shù)(Fis)、遺傳分化系數(shù)(Fst)、Nei無(wú)偏遺傳距離、Hardy-Weinberg平衡(HWE)等指標(biāo)。PIC_CALC軟件對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)信息含量(PIC)分析。

2 結(jié)果

2.1 各微衛(wèi)星位點(diǎn)在總?cè)后w上遺傳變異

等位基因頻率分析結(jié)果如表2所示。SD大鼠總?cè)后w的Na、Ne、Ho、He和PIC結(jié)果見(jiàn)表3。

所檢測(cè)的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為4～8個(gè)。在兩個(gè)SD大鼠群體共有等位基因39個(gè)，北京某單位SD大鼠34個(gè)，上海某單位SD大鼠36個(gè)，有31個(gè)等位基因同時(shí)在兩個(gè)單位SD大鼠中存在，前者SD大鼠特有等位基因3個(gè)，后者為5個(gè)。從表中結(jié)果可以看出，所檢測(cè)的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均具有較好的遺傳多態(tài)性。

表 2 兩個(gè)封閉群SD大鼠7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因頻率分布Table 2 Allele frequencies of 7 microsatellite loci in two closed colonies of SD rats

2.2 兩個(gè)SD大鼠群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)

分別統(tǒng)計(jì)兩個(gè)大鼠群體的Na、Ne、Ho、He和PIC(表4)。從表中數(shù)據(jù)可看出，兩地區(qū)SD大鼠群體的等位基因數(shù)差異較小，兩個(gè)封閉群體均具有豐富的遺傳多樣性。

兩大鼠群體的HWE檢驗(yàn)結(jié)果和Fis見(jiàn)表4。結(jié)果表明兩封閉群體內(nèi)均存在一定程度的近交。

2.3 兩SD大鼠群體間的遺傳關(guān)系

兩SD大鼠群體間Fst (表3)范圍從0.005 1到0.220 3，平均為0.0821，表明中等程度的遺傳分化。Nei (1978)無(wú)偏遺傳相似度和遺傳距離分別為0.8537和0.1582。

表 3 7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在總?cè)后w中的遺傳變異Table 3 Genetic diversities of 7 microsatellite loci across colonies

表 4 7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在兩個(gè)SD大鼠群體中的遺傳信息Table 4 The genetic information of 7 microsatellite loci in two colonies of SD rats

3 討論

3.1 所選微衛(wèi)星位點(diǎn)在SD大鼠群體遺傳檢測(cè)中的適用性

對(duì)封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行遺傳分析，可掌握群體的遺傳概貌，為封閉群動(dòng)物的生產(chǎn)繁育提供理論依據(jù)。本文用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)了北京和上海兩個(gè)單位SD大鼠群體的遺傳狀況。由于微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量多、各位點(diǎn)之間多樣性差異較大，因此，不是每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)都適合用來(lái)進(jìn)行遺傳檢測(cè)。對(duì)封閉群動(dòng)物而言，需要選擇遺傳多樣性豐富的位點(diǎn)。PIC是基因豐富度的衡量指標(biāo)，PIC＞0.5為高度多態(tài)，表示該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性; 0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài); PIC＜0.25為低度多態(tài)，該遺傳標(biāo)記可提供的遺傳信息較差[5]。本文所檢測(cè)的7個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)SD大鼠群體中的PIC范圍在0.292 9～0.809 9(表3), 平均值為0.670 9, 其中只有位點(diǎn)R159的PIC為0.292 9，為中度多態(tài)，其余6個(gè)位點(diǎn)PIC均大于0.5，為高度多態(tài)，高度多態(tài)位點(diǎn)占比85.7%。表明本文所選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)所提供的多態(tài)信息含量豐富，能作為有效的遺傳標(biāo)記用于SD大鼠群體的遺傳分析。

本文中兩大鼠群體在7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的Na為39個(gè), 每個(gè)位點(diǎn)為4～8個(gè), Ne除位點(diǎn)R159為1.445 5外, 其余6個(gè)位點(diǎn)范圍從3.153 7到5.901 6，而傳統(tǒng)的表型檢測(cè)，每個(gè)位點(diǎn)只能檢測(cè)出2～3個(gè)等位基因[6]，因此，相比傳統(tǒng)遺傳檢測(cè)方法，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)更能真實(shí)反映封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳概貌。

3.2 北京和上海兩個(gè)SD大鼠群體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析

封閉群動(dòng)物遺傳學(xué)特點(diǎn)主要體現(xiàn)為個(gè)體間具有較大遺傳變異和群體的遺傳特性保持穩(wěn)定。遺傳變異大小體現(xiàn)在個(gè)體雜合性大小, 而遺傳特性保持穩(wěn)定則是保持群體基因頻率的穩(wěn)定[7]。雜合度(H)和PIC常被用來(lái)評(píng)價(jià)封閉群個(gè)體雜合性高低[8]。H是指群體某位點(diǎn)上雜合子的頻率, 理想的封閉群體H應(yīng)介于0.5～0.7[9]。較高的突變率可使PIC值較高[10], 因此, H和PIC數(shù)值越高說(shuō)明群體遺傳變異越大。本文中北京某單位SD大鼠的Ho和He為0.647 6、0.692 1, 上海為Ho和He為0.585 7、0.713 3, 兩個(gè)群體的雜合度都比較高。北京和上海的SD大鼠在7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的平均PIC分別為0.644 5和0.667 6, 均屬于高度多態(tài), 說(shuō)明兩個(gè)群體均具有較高的遺傳多樣性。

HWE檢驗(yàn)用于衡量群體內(nèi)等位基因頻率是否處于穩(wěn)定，當(dāng)HWE檢驗(yàn)P＞0.05時(shí)，表示群體在該位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)，反之，則偏離HWE[8]。本文中北京某單位SD大鼠有3個(gè)位點(diǎn)偏離HWE，上海某單位SD大鼠有2個(gè)位點(diǎn)偏離平衡狀態(tài)，兩個(gè)種群在其余位點(diǎn)上P(HWE)值＞0.05, 均符合HWE，說(shuō)明群體結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。對(duì)于偏離HWE的位點(diǎn)，可能反映了在繁殖過(guò)程中未能實(shí)現(xiàn)完全的隨機(jī)交配，以致存在一定程度的近交。群內(nèi)近交系數(shù)Fis是種群內(nèi)個(gè)體間的近交系數(shù), 其取值范圍為-1～1，當(dāng)Fis值為正時(shí)，表示群體內(nèi)有近交現(xiàn)象[11]。北京和上海的SD大鼠均有2個(gè)位點(diǎn)的Fis值為正，并且兩個(gè)SD大鼠種群的He均高于Ho，表明兩個(gè)群體中存在部分純合子個(gè)體。結(jié)合2個(gè)位點(diǎn)的Fis＞0，He＞Ho，說(shuō)明本研究所檢測(cè)的北京和上海SD大鼠封閉群內(nèi)存在近交現(xiàn)象[12]。目前，由于對(duì)封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺乏遺傳監(jiān)測(cè)，無(wú)法對(duì)繁育方式和繁育效果進(jìn)行有效的評(píng)估。因此，要保證封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量，除在繁育環(huán)節(jié)要嚴(yán)格遵守相應(yīng)的操作程序外，還應(yīng)定期進(jìn)行遺傳檢測(cè)，從而對(duì)繁育效果作出評(píng)估，對(duì)繁育方式作出及時(shí)調(diào)整。

3.3 北京和上海兩個(gè)SD大鼠群體的遺傳關(guān)系

長(zhǎng)期以來(lái)，全國(guó)各地SD大鼠均處于各自封閉培養(yǎng)的狀態(tài)，是否已經(jīng)出現(xiàn)群體間的遺傳與表型的分離還未可知。對(duì)于本文中的兩個(gè)SD大鼠群體間的遺傳關(guān)系，可從以下幾點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估。首先，從等位基因組成上看，兩個(gè)種群共有基因數(shù)為31, 占總等位基因數(shù)的79.5%，表明兩個(gè)種群間有一定的遺傳差異。遺傳分化指數(shù)Fst是目前應(yīng)用最廣泛的衡量群體間遺傳分化程度的指標(biāo)。當(dāng)Fst＜0.05時(shí),說(shuō)明群體間遺傳分化較弱; 當(dāng) 0.05＜Fst＜0.15 時(shí), 群體間遺傳分化程度中等; 當(dāng) 0.15＜Fst＜0.25 時(shí), 表示群體間遺傳分化較大，F(xiàn)st＞0.25時(shí)，群體間遺傳分化極大[13]。 本文所檢測(cè)的兩個(gè)群體在7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上, 有4個(gè)位點(diǎn)Fst＜0.05, 2個(gè)位點(diǎn)為0.05＜Fst＜0.15, 1 個(gè)位點(diǎn)為 0.15＜Fst＜0.25, 平均值為 0.082 1,即兩個(gè)種群間遺傳分化程度中等。遺傳距離是表示群體間遺傳分化或遺傳差異的重要參數(shù)，本文中兩SD大鼠群體間的Nei (1978)無(wú)偏遺傳距離為0.158 2,同樣表明群體之間中等程度的遺傳差異。

目前，針對(duì)封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)內(nèi)外還未確立公認(rèn)的遺傳檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)。因此，除了長(zhǎng)期的遺傳隔離使不同地區(qū)的SD大鼠封閉群產(chǎn)生遺傳分化外，缺乏有效遺傳監(jiān)測(cè)也是重要原因之一。本研究結(jié)果表明，篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記或可作為對(duì)SD大鼠封閉群進(jìn)行遺傳檢測(cè)的有效手段。

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