抑制G蛋白偶聯(lián)受體35對小鼠缺血性心肌損傷的保護作用

賀磊，楊怡，田玥，王挺，沈陽，裴海峰，楊大春

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPRs)又稱7次跨膜受體，是體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)超家族，目前已發(fā)現(xiàn)1000多個成員[1-3]。GPRs作為細(xì)胞膜上的重要受體，也是一類藥物作用的靶點，目前30%～40%的上市藥物都是基于GPRs而設(shè)計的[4]。研究發(fā)現(xiàn)，GPR35作為G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一個孤兒受體，具有GPRs類膜蛋白的共同特征，但其生物學(xué)功能仍未完全明確[5]。

GPR35廣泛分布在白細(xì)胞、單核細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞中，并在脾臟、心臟等器官中呈中等水平表達(dá)[6-7]。隨著新技術(shù)的應(yīng)用[8]，目前已證實GPR35可能與疼痛[9]、炎癥[10]和哮喘[11]等多種疾病相關(guān)，并有研究表明GPR35與心血管系統(tǒng)疾病如高血壓[12]、冠狀動脈疾病[13]等密切相關(guān)。全基因組相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)GPR35單核苷酸多態(tài)性與冠狀動脈的鈣化等病變密切相關(guān)[13]。因此GPR35有可能成為一個新穎的、有潛力的心血管疾病治療靶標(biāo)。Ronkainen等[14]研究發(fā)現(xiàn)GPR35可被缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)激活，但并未進(jìn)一步證實其在心肌缺氧/缺血損傷中的作用。本研究利用已證實的GPR35抑制劑CID2745678，采用心肌細(xì)胞系低氧環(huán)境及小鼠心肌梗死模型驗證GPR35在缺血性心血管疾病中的作用，以期為缺血性心肌損傷提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及動物 小鼠心肌細(xì)胞系(MCM)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。8～10周齡C57雄性小鼠40只，體重25g左右，購自成都達(dá)碩生物公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后再開展實驗。

1.1.2 試劑 高糖型(4500mg/L) DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)，胎牛血清(Sigma公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，反轉(zhuǎn)錄及PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司)，q-PCR引物(成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司)，流式凋亡試劑盒(美國BD公司)，TUNEL染色試劑盒、DAPI胞核熒光染料(美國Roche公司)，Masson染色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(上海碧云天公司)，β-actin單克隆抗體(Santa Cruz Biotech公司)，GRR35單克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 MCM低氧模型的建立及MCM培養(yǎng) 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長融合至80%～90%時用胰蛋白酶消化，按1∶2比例將細(xì)胞懸液接種于55cm2培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)為1×105/ml，接種于21cm2培養(yǎng)皿，給予不同干預(yù)并按分組進(jìn)行實驗。

1.2.2 MCM低氧模型 心肌細(xì)胞正常傳代至60mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞融合至50%左右時，將培養(yǎng)皿置于低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(3%O2，5%CO2，92%N2)6h，缺氧處理前更換為無血清無糖培養(yǎng)基。為檢測GPR35在缺氧中的變化將小鼠心肌細(xì)胞分為常氧組、缺氧組；為進(jìn)一步驗證GPR35抑制劑的作用，將心肌細(xì)胞分為常氧組、缺氧組、缺氧+溶劑組、缺氧+CID2745678組。缺氧+CID2745678組在缺氧干預(yù)前6h加入濃度為3μm/L的GPR35抑制劑CID2745678；缺氧+溶劑組在缺氧干預(yù)前6h加入等量溶劑。

1.2.3 小鼠心肌梗死模型 動物實驗：為檢測GPR35在心肌缺血條件下的變化，將雄性C57小鼠分為假手術(shù)組(n=6)，心梗組(n=8)。心梗組正常建模，假手術(shù)組小鼠除不結(jié)扎前降支冠脈外，其余流程均同心梗組。為進(jìn)一步驗證GPR35抑制劑的作用，將小鼠分為假手術(shù)組(n=6)、心梗組(n=8)、心梗+溶劑組(n=8)、心梗+CID2745678組(n=8)。心梗+CID2745678組分別在術(shù)前及術(shù)后24h腹腔注射12μg/kg CID2745678；心梗+溶劑組術(shù)前及術(shù)后24h腹腔注射等量溶劑。利用Gao等[15]動物模型制備方法進(jìn)行建模。0.4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，固定于實驗臺上，循胸骨左側(cè)第4、5肋間做一長2cm左右的縱行切口，采用4-0線沿切口周圍皮膚做一荷包；止血鉗鈍性分離胸大肌與胸小肌，再分開肋骨暴露心臟，可見左側(cè)冠狀動脈前降支，用6-0縫合線在左心耳下緣處結(jié)扎前降支，送回心臟并排除胸內(nèi)氣體，收緊荷包并關(guān)閉胸腔。

1.2.4 q-PCR測心肌細(xì)胞GPR35 mRNA表達(dá)水平采用Trizol法提取MCM總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用q-PCR法進(jìn)行基因擴增測定GPR35 mRNA表達(dá)量。18S為內(nèi)參基因，用2–ΔΔCt法分析結(jié)果。引物序列如下：18S：正義5′-CGCGGTTCTATTTT GヰGGヰT-3′，反義5′-GCGCCGGTCCAAGAAヰT-3′；GPR35：正義5′-ATCACAGGTAAACTCTCAGACAC CAACT-3′，反義5′-CTTGAACGCTTCCTGGAACTC T-3′。

1.2.5 Western blotting檢測GPR35蛋白表達(dá)水平待心肌細(xì)胞系經(jīng)實驗條件處理結(jié)束后，正常消化細(xì)胞至離心管，PBS洗滌后加入蛋白裂解液，BCA法檢測蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度加入適量樣品。配制SDS-PAGE凝膠后行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉3h，分別加入相應(yīng)的抗體GPR35及β-actin，4℃孵育過夜后加二抗，孵育3h后ECL法顯色。心肌梗死小鼠正常取材，先用預(yù)冷的冰PBS清洗心臟組織后加入預(yù)冷的裂解液并剪碎組織樣品，勻漿心臟組織后，4℃、12 000×g離心10min，留取上清液，余步驟相同。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定心肌細(xì)胞凋亡水平 用0.25%不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC及PI染料并混勻，同時設(shè)置空白組，室溫避光孵育15min，1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.7 TUNEL熒光染色檢測心肌細(xì)胞凋亡水平利用DAPI和TUNEL雙染法測定心肌細(xì)胞凋亡水平，藍(lán)色為心肌細(xì)胞核，而綠色則為凋亡心肌細(xì)胞核。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=陽性心肌細(xì)胞數(shù)/總心肌細(xì)胞數(shù)×100%。按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，最后在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)，再用Image-Pro軟件分析心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 小鼠心功能檢測 小鼠心肌梗死模型建立4周后，用0.4%水合氯醛麻醉小鼠后置于檢測臺上，小鼠的心率維持在400次/min以上時開始進(jìn)行超聲檢測。利用Visual Sonics Vevo770高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)及專用小鼠RMV707B高頻探頭，行B型及M型超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù)值(LVEF)與左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)等，同時留取典型超聲影像圖片。

1.2.9 Masson染色檢測小鼠心肌纖維化水平 小鼠經(jīng)心臟功能檢測后，處死小鼠并取出心臟，在KCl溶液中浸泡使其呈舒張狀態(tài)，浸泡于4%多聚甲醛中固定48h，石蠟包埋，制成石蠟切片。按照Masson染色試劑盒說明書染色，并調(diào)整染色時間。具體步驟如下：事先制備好的石蠟組織塊切片經(jīng)脫蠟至水處理后備用；利用Harris蘇木素染料染胞核10min，水洗；再經(jīng)過分化、水洗、返藍(lán)、水洗等處理，用Masson復(fù)合染色液對切片染色12min；0.2%的醋酸溶液速洗5s兩次，1%的磷鉬酸液體處理5min，0.2%的醋酸速洗2次；利用苯胺藍(lán)液或綠液復(fù)染5min，1%冰醋酸處理1min；新鮮的95%乙醇及無水乙醇脫水，然后二甲苯透明，中性樹膠封片處理。最后在熒光顯微鏡下觀察各組的組織切片并拍照，分析計算纖維化水平。藍(lán)色顯示為膠原纖維，紅色顯示為肌纖維。左心室藍(lán)色部分面積/左心室面積即可得出左室心肌纖維化水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)　果

2.1 缺氧/缺血環(huán)境對GPR35表達(dá)的影響 q-PCR及Western blotting檢測結(jié)果顯示，MCM經(jīng)缺氧處理后，缺氧組GPR35 mRNA及蛋白表達(dá)水平較常氧組均明顯升高(P＜0.01或P＜0.05，圖1A、B)。C57小鼠結(jié)扎左冠狀動脈前降支模擬心肌梗死3d后心臟取材，q-PCR及Western blotting檢測結(jié)果顯示，心梗組GPR35 mRNA及蛋白表達(dá)水平均較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01或P＜0.05，圖1C、D)。

2.2 抑制GPR35對低氧條件下心肌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與常氧組比較，缺氧組、缺氧+溶劑組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)，而缺氧+CID2745678組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與缺氧組比較，缺氧+溶劑組心肌細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而缺氧+CID2745678組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)；與缺氧+溶劑組比較，缺氧+CID2745678組細(xì)胞凋亡率明顯下降(圖2A、B，P＜0.05)。TUNEL熒光檢測結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致(圖2C、D)。

圖1 缺氧/缺血環(huán)境對GPR35 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of hypoxia/ischemia on mRNA and protein level of GPR35

圖2 抑制GPR35對低氧條件下心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Inhibition of GPR35 preserved the viability of hypoxic myocardial cells

2.3 抑制GPR35對心肌梗死小鼠心肌組織纖維化的影響 術(shù)后4周使用小動物超聲檢測小鼠心臟功能，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，心梗組、心梗+溶劑組LVEF、LVFS明顯降低(P＜0.05)，而心梗+CID2745678組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與心梗組比較，心梗+溶劑組LVEF、LVFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而心梗+CID2745678組LVEF、LVFS明顯改善(P＜0.05)；與心梗+溶劑組比較，心梗+CID2745678組心臟LVEF、LVFS明顯改善(圖3A–C，P＜0.05)。Masson染色也提示抑制GPR35后心臟左室纖維化明顯減輕(圖3D，P＜0.05)。

3 討　論

近年來隨著疾病譜的變化，心血管系統(tǒng)疾病負(fù)擔(dān)日漸加重，已成為我國乃至世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題[16-17]?！吨袊难懿蟾?014》指出，我國心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為44.8%，城市為41.9%[18]。缺血性心臟病是指由于冠脈循環(huán)狹窄或阻塞引起心臟氧供失衡，并由此導(dǎo)致心肌細(xì)胞的缺失及心肌瘢痕形成，最終致心室功能衰竭的一類疾病[19]，目前的治療方法包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(PCI)、冠狀動脈搭橋術(shù)(CABG)等，均有相應(yīng)的適應(yīng)證及利弊。深入探索缺血性心臟病的發(fā)病機制并尋找更合適的干預(yù)靶點有著重要的臨床意義。

圖3 抑制GPR35對心肌梗死小鼠心肌組織纖維化的影響Fig.3 Effects of inhibiting GPR35 on myocardial fibrosis of MI mice

眾所周知，許多GPRs直接參與了疾病的病理過程，因此是較為理想的治療靶點，而部分藥物的確是GPRs的配體[20]。但是目前僅約1/6的非嗅覺相關(guān)GPRs被開發(fā)為藥物，因此需要更多的研究投入其中[14]。GPR35因與眾多疾病相關(guān)，自1998年發(fā)現(xiàn)以來便被作為潛在的治療靶點獲得研究者極大的關(guān)注[5]。然而，因缺乏明確可信的內(nèi)源性配體，阻礙了對GPR35功能的進(jìn)一步理解及其作為藥物靶點的繼續(xù)開發(fā)。相關(guān)研究表明，GPR35在小鼠心衰模型、急性心肌梗死階段以及心肌肥厚的代償及非代償期表達(dá)均明顯升高，而過表達(dá)GPR35可使心肌細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白、細(xì)胞骨架排列發(fā)生紊亂，并導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的變化[21]。但上述研究并未進(jìn)一步探究GPR35在心肌缺血缺氧損傷中的具體作用。Min等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠比較，GPR35敲除小鼠血壓明顯升高，而患者發(fā)生心衰時也伴有GPR35基因表達(dá)的增加。在細(xì)胞水平，腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞過表達(dá)GPR35后，細(xì)胞會發(fā)生類似心肌肥厚的改變并且伴隨細(xì)胞活力的下降[12]。以上研究均提示GPR35在心血管疾病中有重要的作用。

心肌缺氧/缺血是多種心血管疾病發(fā)生的必經(jīng)過程，進(jìn)一步闡明GPR35在其中的作用具有重要意義。本實驗利用心肌細(xì)胞系低氧環(huán)境及小鼠心肌梗死模型來模擬心血管疾病，研究GPR35的變化及其在該病理過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧/缺血環(huán)境可誘導(dǎo)GPR35的表達(dá)，與其他研究結(jié)果[21]一致，亦證實其可能參與該病理過程。而GPR35本身表達(dá)升高可能出現(xiàn)在整個病程中，在心肌急性缺血以及疾病進(jìn)一步惡化導(dǎo)致的心衰過程中可能均有較高的表達(dá)，后續(xù)實驗將繼續(xù)在模型中進(jìn)行驗證。CID2745678是目前已被證實的GPR35活性抑制劑[9]，能夠抑制低氧環(huán)境導(dǎo)致的心肌細(xì)胞系凋亡，并能進(jìn)一步減輕心肌梗死后的心肌重塑并改善心功能。作為GPRs中的一員，GPR35被激活后可能的下游分子包括Rho蛋白A(Rho A)、Ca2+、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)等[11]，而這些下游分子可作為第二信使參與多種生理過程。在心肌缺血性疾病中，GPR35表達(dá)升高，最終可能通過多條途徑影響細(xì)胞的代謝及凋亡。但是，目前仍未明確GPR35是通過何種信號通路影響細(xì)胞凋亡的，仍須進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究驗證了GPR35在心肌缺氧/缺血損傷中的作用，其活性抑制劑CID2745678能夠減輕心肌缺氧/缺血損傷，為GPR35作為新的藥物干預(yù)靶點提供了理論基礎(chǔ)。

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