濱蒿總黃酮體內(nèi)外抗甲型流感病毒作用的研究

姚 華，劉 燕，楊巧麗，史玉柱，王 雪，卞海濤，黃 華*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054 )

由流感病毒引起的流行性感冒是一種急性傳染病。流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)流感病毒內(nèi)部蛋白抗原性的不同分為甲、乙和丙3型[1]，甲型流感病毒廣泛存在于自然界，除感染人外，流感病毒在動(dòng)物體內(nèi)也廣泛存在，常常能引起人和動(dòng)物的流感大流行，甚至出現(xiàn)死亡。此外，甲型流感病毒表面抗原極易發(fā)生變異，導(dǎo)致新的病毒“亞型”出現(xiàn)，而人體往往無法產(chǎn)生抵御新生病毒的抗體，從而造成流感的全球性大爆發(fā)，因此，甲型流感病毒是危害程度最高的一種流感病毒。

雖然21世紀(jì)科學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)，但人類至今無法征服流感，流感病毒的研究仍是當(dāng)今病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。奧司他韋、金剛烷胺和利巴韋林等是臨床上有效的抗流感病毒藥，由于其不良反應(yīng)大、易出現(xiàn)耐藥性，在臨床使用上受到限制。流感病毒易發(fā)生突變，從而影響流感疫苗的應(yīng)用。因此，急需尋找到不良反應(yīng)少且療效確切的抗流感病毒天然藥物。

中醫(yī)藥在防治流感方面有著悠久的用藥史和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，具有多靶點(diǎn)、低毒性和不良反應(yīng)少的優(yōu)勢(shì)。目前，國內(nèi)外對(duì)中藥抗病毒研究增多，仍以新藥研發(fā)為目的，利用現(xiàn)代科技，從中藥中尋找有抗病毒作用的有效成分。近年來，我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種中藥的活性成分具有良好的抗病毒作用，如桂枝揮發(fā)油、荊芥揮發(fā)油、靈芝多糖、濱蒿黃酮和黃芪苷等[2]，為從傳統(tǒng)中藥中進(jìn)一步尋找抗病毒有效部位或有效成分奠定了基礎(chǔ)。

濱蒿(ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.)為菊科蒿屬植物，維吾爾名“西瓦克”，是維吾爾醫(yī)傳統(tǒng)用藥，具有清熱解毒、消敗津、開竅化痰和除積物等功效[3]，民間常用濱蒿水煎劑預(yù)防感冒。濱蒿的化學(xué)成分主要有黃酮類、香豆素、有機(jī)酸、色原酮、烯炔和醛酮等[4-6]。本課題組前期采用大孔樹脂與聚酰胺樹脂聯(lián)用吸附純化技術(shù)提取分離濱蒿總黃酮的活性成分，發(fā)現(xiàn)水提物中總黃酮含量較高，對(duì)其進(jìn)行了藥物初篩，結(jié)果顯示，其具有較好的抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗炎等藥效[7-10]。在此基礎(chǔ)上，本課題組根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，將濱蒿總黃酮的提取分離條件優(yōu)化，獲得總黃酮含量為54.27%的濱蒿總黃酮提取物，并對(duì)濱蒿總黃酮體內(nèi)外抗病毒作用進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 HH.CP-01型CO2培養(yǎng)箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司)；BS200S精密型電子天平(北京賽多利斯天平有限責(zé)任公司)；MDF-382E型超低溫冰箱(日本三洋電器)；BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；SIM-SIR獨(dú)立換氣系統(tǒng)籠具(上海紹豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 濱蒿總黃酮提取物是新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所采用聚酰胺樹脂和HPD100型大孔樹脂吸附方法制備(黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.27%，批號(hào)20141028)。陽性對(duì)照藥：復(fù)方一枝蒿顆粒(30 g·人·d-1，國藥準(zhǔn)字Z20026711，新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，批號(hào)140111)；利巴韋林片(0.45 g·人·d-1，國藥準(zhǔn)字H20033538，江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)1404013)；小鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6，北京四正柏生物科技有限公司)；小鼠白細(xì)胞介素-8(IL-8，上海西塘生物科技有限公司)。

1.3病毒與細(xì)胞 甲型流感病毒A/京防/262/95(H1N1)及流感病毒鼠肺適應(yīng)株P(guān)R/8/H1N1，甲型流感病毒經(jīng)雞胚尿囊腔傳代后-80℃低溫冰箱備用；人喉癌上皮細(xì)胞株(Hep2)，均購于中國預(yù)防醫(yī)科院病毒研究所。

1.4動(dòng)物 18～20 g昆明小鼠，購買于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(新)2011-0004。

2 方法

2.1對(duì)流感病毒PR8感染小鼠肺指數(shù)及肺勻漿IL-6和IL-8含量的測(cè)定 昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，共70只，隨機(jī)分成濱蒿總黃酮0.10，0.20和0.40 g·kg-1組、利巴韋林組、復(fù)方一枝蒿顆粒組、病毒對(duì)照組和對(duì)照組，共7組。用乙醚麻醉小鼠，各組以50 μL含流感病毒的PR/8/H1N1尿囊液滴鼻，對(duì)照組用50 μL生理鹽水滴鼻。于感染后1 h各組按照相應(yīng)劑量給藥，對(duì)照組和病毒對(duì)照組同等條件給予蒸餾水，每日2次，連續(xù)7 d。于末次給藥后小鼠禁食不禁水8 h，稱定小鼠體質(zhì)量，摘眼球放血致死，摘取全肺稱定質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率[11-12]；制作肺勻漿，并測(cè)定肺勻漿中IL-6和IL-8的含量[13]。

肺指數(shù)=肺濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)

肺指數(shù)抑制率=(病毒對(duì)照組肺指數(shù)均數(shù)-各給藥組肺指數(shù)均數(shù))/病毒對(duì)照組肺指數(shù)均數(shù)×100%

2.2對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用 將濱蒿總黃酮提取物配制成質(zhì)量濃度為2 500，1 250，625，312，156，78，39和20 μg·mL-1的藥液，加入到已長成單層的Hep-2細(xì)胞的96孔板中，每孔200 μL，設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察藥液對(duì)細(xì)胞是否有毒性出現(xiàn)。確定不出現(xiàn)細(xì)胞病變的最低藥物質(zhì)量濃度為最大無毒質(zhì)量濃度(TC0)，并按照Reed-Muench 法計(jì)算50%細(xì)胞毒性質(zhì)量濃度(TC50)[14-16]。

2.3體外抗甲型流感病毒作用 用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，待其長成單層，將100倍半數(shù)細(xì)胞感染量(100TCID50)的病毒液100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，35 ℃吸附1 h后，棄上清病毒液。加入TC0及以下的7個(gè)質(zhì)量濃度的濱蒿總黃酮，100μL/孔，同事設(shè)正常對(duì)照和病毒對(duì)照，并以利巴韋林為陽性對(duì)照。將培養(yǎng)板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)病毒對(duì)照組的細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按照Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50，選擇指數(shù)SI=TC50/IC50。細(xì)胞病變按照六級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷，即：-：細(xì)胞生長正常，無病變出現(xiàn)；±：細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10%；+：細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的25%以下；++：細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的50%以下；+++：細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以下；++++：細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上[14-16]。

3 結(jié)果

3.1對(duì)肺指數(shù)及肺勻漿IL-6和IL-8水平的測(cè)定 見表1～2。由表1可知，甲型流感病毒PR/8/H1N1感染小鼠后，病毒對(duì)照組小鼠肺指數(shù)明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；濱蒿總黃酮0.10，0.20和0.40 g·kg-1劑量組肺指數(shù)明顯降低，肺指數(shù)抑制率為32.3%～45.53%。由表2可知，病毒感染小鼠后病毒對(duì)照組IL-6和IL-8水平與正常組比較顯著升高；經(jīng)過治療后，濱蒿總黃酮0.10，0.20和0.40 g·kg-1劑量組、利巴韋林組和復(fù)方一支蒿顆粒組均能使小鼠肺勻漿IL-6水平顯著降低(P<0.01)；濱蒿總黃酮0.40 g·kg-1劑量組及利巴韋林組能使小鼠肺勻漿IL-8水平明顯降低(P<0.05)。

表1濱蒿總黃酮對(duì)肺指數(shù)的影響

注：與對(duì)照組比較##P<0.01；與病毒對(duì)照組比較**P<0.01。—表示同等條件給予蒸餾水。

3.2對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性檢測(cè) 此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將濱蒿總黃酮加入細(xì)胞培養(yǎng)板后，Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞變圓且折光性增加。濱蒿總黃酮最大無毒質(zhì)量濃度(TC0)為156 μg·mL-1，TC50為380 μg·mL-1，隨著濱蒿總黃酮質(zhì)量濃度的降低對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用減輕。

表2濱蒿總黃酮對(duì)肺勻漿中IL-6和IL-8水平的影響

注：與對(duì)照組比較﹟﹟P<0.01；與病毒對(duì)照組比較＊P<0.05，＊＊P<0.01?！硎就葪l件給予蒸餾水。

3.3藥物對(duì)流感病毒致細(xì)胞病變的影響 重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。病毒對(duì)照組細(xì)胞病變表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹圓縮、部分細(xì)胞脫落甚至死亡。顯微鏡下觀察，病毒對(duì)照組病變顯著，對(duì)照組無病變，濱蒿總黃酮組隨著質(zhì)量濃度升高表現(xiàn)出對(duì)病毒致細(xì)胞病變的抑制作用越明顯，見圖1。按照Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為6.9 μg·mL-1，治療指數(shù)SI為55.1。

圖1濱蒿總黃酮對(duì)甲型流感病毒的抑制作用(×100)

A.對(duì)照組；B.病毒對(duì)照組；C.濱蒿總黃酮組；D.利巴韋林組。

Fig.1 Inhibition of the total flavone ofArtemisiascopariaon influenza A virus(×100)

A.control group；B.virus control group；C.the total flavone ofArtemisiascopariagroup；D.ribavirin group.

4 討論

雖然濱蒿和茵陳蒿是中藥茵陳的主要植物來源，但對(duì)濱蒿黃酮類成分及其藥理活性的研究鮮有報(bào)道。本文通過體外感染Hep-2細(xì)胞模型和病毒性肺炎動(dòng)物模型來研究濱蒿總黃酮對(duì)甲型流感病毒的抗病毒作用。

體內(nèi)抗流感采用甲型流感病毒PR/8/H1N1病毒株感染小鼠7 d后，病毒對(duì)照組小鼠肺指數(shù)及肺勻漿中IL-6和IL-8的水平明顯增高，口服給藥能顯著降低感染小鼠的肺指數(shù)，結(jié)果表明，濱蒿總黃酮可緩解肺部炎癥，有明顯治療作用。同時(shí)，降低致炎因子IL-6和IL-8的水平，可能通過平衡免疫因子發(fā)揮間接的抗病毒作用，對(duì)小鼠肺部炎癥有明顯的治療作用。甲型流感病毒感染后的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)NF-kB和AP-1活化，磷酸化NF-kB和AP-1入核后調(diào)控下游多種生物學(xué)活性的致炎細(xì)胞因子的TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的表達(dá)[17-18]。如果病毒不能被及時(shí)清除，就會(huì)造成大量炎性細(xì)胞的浸潤從而損傷正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引起病毒性肺炎[19]。IL-6是主要促炎細(xì)胞因子之一，可作用于多種靶細(xì)胞，與其他細(xì)胞因子相互作用，增強(qiáng)免疫作用和促進(jìn)造血，參與炎癥反應(yīng)，能激活淋巴細(xì)胞，促進(jìn)抗體的生成。IL-8主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可趨化中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞進(jìn)入感染部位，包括IL-8在內(nèi)的多種CXC趨化性細(xì)胞因子和成纖維細(xì)胞生長因子可促進(jìn)血管的新生[20]。結(jié)果表明，濱蒿總黃酮可能是通過降低IL-6和IL-8水平，抑制免疫應(yīng)答，既對(duì)組織進(jìn)行損傷修復(fù)，也可減輕病毒感染后肺組織出現(xiàn)的免疫病理損害，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，從而具有重要的病理生理意義。

CPE法通過觀察濱蒿總黃酮對(duì)甲型流感病毒A/京防/262/95(H1N1)感染Hep-2細(xì)胞的病變觀察，結(jié)果顯示：利巴韋林和濱蒿總黃酮提取物對(duì)甲型H1N1流感病毒有明顯的抑制作用，說明對(duì)甲型H1N1流感病毒所致細(xì)胞病變有保護(hù)作用。

由于流感病毒感染過程中的相關(guān)病理學(xué)和免疫學(xué)反應(yīng)復(fù)雜，單一抗病毒抗炎策略很難達(dá)到預(yù)防和治療效果。中藥在抗流感方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景，可通過減輕肺部炎癥、直接或間接抑制病毒復(fù)制通路和調(diào)節(jié)免疫抗炎等功能，共同發(fā)揮抗病毒功效。目前，中藥活性成分的研究已成為新藥研發(fā)的新方向，具有地域特色中草藥植物的藥用成分的研究逐漸受到重視。濱蒿是新疆維吾爾醫(yī)用于防治感冒的常用藥材，本文主要研究濱蒿總黃酮在體內(nèi)外的抗甲型流感病毒作用，為其在臨床應(yīng)用及開發(fā)方面提供抗流感實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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