離子色譜法測(cè)定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖和維生素C的含量

豐 航，陳德妙，李 榮，單 敏

(1.陜西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710068；2.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054)

鹽酸氨基葡萄糖(分子式 C6H13NO5·HCl)是甲殼素降解后生成的一種還原糖，又稱D-葡萄糖胺鹽酸鹽(D-glucosamine hydrochloride，GAH)，是存在于機(jī)體內(nèi)尤其是關(guān)節(jié)軟骨中的氨基單糖，可刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生正常多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白多糖，對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎具有很好的療效[1-2]，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于葡維氨糖膠囊中；維生素C是人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，具有抗氧化、強(qiáng)身健腦、促進(jìn)骨膠原生物合成等功效，葡維氨糖膠囊中將二者結(jié)合用作增強(qiáng)關(guān)節(jié)免疫能力、促進(jìn)軟骨創(chuàng)傷的愈合。目前，常用的鹽酸氨基葡萄糖含量檢測(cè)方法主要有HPLC法[3-9]、紫外-可見分光光度法[10-11]和液質(zhì)聯(lián)用法[12]；而維生素C常用的檢測(cè)方法為比色法、熒光法及高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法[13-20]。尚未見同時(shí)檢測(cè)該2種成分的文獻(xiàn)報(bào)道。本文將利用鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的電導(dǎo)性質(zhì)，采用離子色譜對(duì)其進(jìn)行分離，借助電導(dǎo)檢測(cè)器同時(shí)進(jìn)行二者的含量測(cè)定。該法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好，可為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ICS-3000離子色譜儀(美國(guó)戴安公司)，配有電導(dǎo)檢測(cè)器。

1.2試藥 鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)140649-201304，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)，抗壞血酸對(duì)照品(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號(hào)111706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9% )；水為超純水；葡維氨糖膠囊(威?？祵毶锟萍加邢薰荆?hào)541016406)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取100 mg鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品和100 mg抗壞血酸(即維生素C)對(duì)照品，分別置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取該溶液各25 mL混合，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為50，100，200，300，400和500 μg·mL-1的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液 取適量膠囊內(nèi)容物，用研缽研細(xì)，混勻，稱取25 mg，置于100 mL量瓶中，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3陰性樣品溶液 取適量不含鹽酸氨基葡萄糖和維生素C的陰性樣品，用研缽研細(xì)，混勻，稱取25 mg，置于100 mL量瓶中，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為陰性樣品溶液。

2.1.4溶劑空白溶液 取100 mL水，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為溶劑空白溶液。

2.2色譜條件 色譜柱：Ion Pac AS-19(250 mm×4 mm)；保護(hù)柱：Ion Pac AG-19(50 mm×4 mm)；淋洗液：10 mmol·L-1氫氧化鉀溶液(在線淋洗液發(fā)生器生成)；抑制電流：25 mA；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；進(jìn)樣量：25 μL。色譜圖見圖1。

圖1離子色譜圖

A.對(duì)照品溶液；b.供試品溶液；c.陰性樣品溶液；d.溶劑空白溶液；1.維生素C；2.鹽酸氨基葡萄糖。

Fig.1 Ion chromatograms

A.reference substances solution;b.sample solution;c.negative solution;d.solvent blank solution；1.vitamin C；2.glucosamine hydrochloride.

2.3測(cè)定法 分別取2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)保留時(shí)間定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2.4線性關(guān)系考察 取2.1.1項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣25 μL，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸氨基葡萄糖回歸方程為y=0.039 4x-0.286 2，r=0.999 9；維生素C的回歸方程為y=0.037 4x-0.242 7，r=0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸氨基葡萄糖與維生素C質(zhì)量濃度在50～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察 取質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，每次25 μL，記錄峰面積及保留時(shí)間。鹽酸氨基葡萄糖與維生素C 峰面積的RSD值分別為0.33%和0.35%，保留時(shí)間RSD值分別為0.12%和0.17%，結(jié)果表明，二者精密度均良好。

2.6重復(fù)性考察 取同一批號(hào)供試品，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，6份樣品鹽酸氨基葡萄糖與維生素C含量的RSD 值分別為1.12%和1.25%，結(jié)果表明，重復(fù)性均良好。

2.7穩(wěn)定性考察 取已經(jīng)制備好的供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，18和24 h進(jìn)樣，記錄鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的峰面積,計(jì)算得RSD值分別為1.85%和2.57%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率考察 精密稱取已測(cè)含量的葡維氨糖膠囊9份，各25 mg(分為3個(gè)水平，每個(gè)水平3平行)，分別置于100 mL量瓶中。3個(gè)水平分別精密加入鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為1.008 mg·mL-1)各13.5，17.0和20 mL以及維生素C對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為1.004 mg·mL-1)各1.0，1.3和1.6 mL，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為回收率實(shí)驗(yàn)待測(cè)溶液。經(jīng)計(jì)算，鹽酸氨基葡萄糖平均回收率為98.91%，RSD值為0.62%；維生素C平均回收率為98.46%，RSD值為0.88%。見表1～2。

表1鹽酸氨基葡萄糖回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The results of glucosamine hydrochloride recovery test

序號(hào)加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%113.613.599.2698.910.62213.613.498.53313.613.498.53417.116.998.83517.116.998.83617.116.797.66720.220.199.50820.220.199.50920.220.199.50

表2維生素C回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 The results of vitamin C recovery test

序號(hào)加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%11.001.01101.0099.460.8821.001.00100.0031.001.00100.0041.311.3099.2451.311.31100.0061.311.3099.2471.611.5998.7681.611.5998.7691.611.5898.14

2.9檢測(cè)限和定量限 取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用水稀釋制成不同質(zhì)量濃度的溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按照S/N≥3計(jì)算鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度均為0.1 μg·mL-1；維生素C的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度均為0.2 μg·mL-1；按照S/N≥10計(jì)算鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.3 μg·mL-1；維生素C的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.6 μg·mL-1。

2.10供試品測(cè)定 按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的含量。結(jié)果顯示，葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的含量為238.0 mg·粒-1；維生素C的含量為18.23 mg·粒-1。

3 討論

3.1檢測(cè)方法的選擇 鹽酸氨基葡萄糖的常用含量檢測(cè)方法主要有HPLC法、紫外-可見分光光度法和液質(zhì)聯(lián)用法。由于該化合物在紫外區(qū)缺乏特征吸收，故在利用HPLC法時(shí)，只能采用紫外檢測(cè)器(紫外末端吸收法或柱前衍生法)或蒸發(fā)管檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。采用紫外末端吸收法靈敏度較低；蒸發(fā)光檢測(cè)器法雜質(zhì)干擾大；而柱前衍生法操作繁瑣。利用紫外-可見分光光度法對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，選擇性很難達(dá)到要求。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在儀器方面成本投入過大，不利于推廣。維生素C目前常用的檢測(cè)方法為比色法、熒光法及高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法，比色法和熒光法對(duì)于復(fù)雜化合物的測(cè)定選擇性較差；采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法則很難與測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖相兼容。但鹽酸氨基葡萄糖與維生素C均為水溶性化合物，具有導(dǎo)電性。利用這2種化合物的這一性質(zhì)，本文選用離子色譜法-電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行分離、測(cè)定。

3.2離子色譜柱的選擇 鹽酸氨基葡萄糖與維生素C在其水溶液中均呈陰離子，帶有負(fù)電荷。故采用Ion Pac AS-19陰離子交換柱(250 mm×4 mm)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)該陰離子的分離。由于樣品處理方法較為簡(jiǎn)單，僅為加水超聲溶解，故在分離柱前增加同型號(hào)的預(yù)柱Ion Pac AG-19(50 mm×4 mm)進(jìn)行柱保護(hù)。

3.3國(guó)標(biāo)液相方法與本法比較 現(xiàn)行的鹽酸氨基葡萄糖測(cè)定方法為GB/T 20365-2006，該法中針對(duì)鹽酸氨基葡萄糖采用HPLC法，選用C18柱為分離柱，192 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。由于該化合物的極性較大，在C18柱上很難保留，在2.5 min內(nèi)即出峰。過早的出峰，除了與溶劑峰保留時(shí)間接近外，和樣品中雜質(zhì)峰難以分開，干擾過大。此外，195 nm為紫外檢測(cè)器的末端吸收，在該波長(zhǎng)下檢測(cè)對(duì)流動(dòng)相試劑要求很高，檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相對(duì)結(jié)果影響很大。本法利用該化合物的電導(dǎo)性，選用陰離子色譜柱作為分離柱，用電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。該法靈敏度高，鹽酸氨基葡萄糖最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1,維生素C質(zhì)量濃度為0.2 μg·mL-1,準(zhǔn)確度和重復(fù)性均良好，可為國(guó)家制定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持和參考依據(jù)。

[1] Johanne M P，Lukas M W，Jean-Pierre P.Future therapeutics for osteoarthritis[J].Bone，2012，51：297-311.

[2] 陳怡.硫酸氨基葡萄糖臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè)，2012，21(9)：96-封2．

[3] 李璟，李志偉，王立峰．HPLC法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖口腔崩解片中鹽酸氨基葡萄糖的含量[J]．河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(1)：69-71．

[4] 廖栩，王淑君，佟巖，等．柱前衍生化法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖軟膏的含量[J]．沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28(5)：380-383．

[5] 吳虹，顧宏霞，王效山．HPLC-ELSD測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖含量[J]．安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，27(2)：41-43．

[6] GB/T 20365-2006，硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測(cè)定液相色譜法[S].

[7] 羅立，但漢雄．氨基柱HPLC法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖及其制劑的含量[J]．中國(guó)藥師，2016，19(2)：387-389．

[8] 狄平平，勞苑子，趙立平，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方氨基葡萄糖片中鹽酸氨基葡萄糖和硫酸軟骨素含量[J]．中國(guó)藥事，2010，24(3)：283-286．

[9] 張德柱，宋愿智，沈登林．鹽酸氨基葡萄糖膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法研究[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29(3)：252-255．

[10]WS1-(X-090)-2005Z，鹽酸氨基葡萄糖膠囊[S].

[11]王維，尤瑜敏，周培根．D-氨基葡萄糖測(cè)定方法的比較[J].食品研究與開發(fā)，2003，24(2)：84-87．

[12]張華珺，張喆，張蓉．氨基葡萄糖液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用含量測(cè)定方法研究[J]．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23(5)：1148-1150．

[13]周濤，江維克，艾強(qiáng)，等．貴州刺梨中總維生素C及還原型維生素C含量檢測(cè)方法的建立與比較[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(9)：37-40．

[14]王玉潔，薛健，石上梅．中藥中維生素C含量測(cè)定方法對(duì)比研究[J]．中國(guó)現(xiàn)代中藥，2017，19(2)：214-216．

[15]劉真真，齊沛沛，王新全，等．超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定果蔬中維生素C[J]．色譜，2016，34(11)：1048-1054．

[16]李元玲，賀龍強(qiáng).紫外分光光度法測(cè)定新鮮蔬菜中維生素C的含量[J]．焦作大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，(3)：93-94．

[17]于曉萍．分光光度法快速測(cè)定蔬菜水果中維生素C的含量[J]．工程技術(shù)與應(yīng)用，2009，6(2)：16-18．

[18]沈黎，劉玉春.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方亞油酸乙酯膠丸中維生素C和煙酸的含量[J]．中國(guó)藥業(yè)，2012，21(14)：50-51．

[19]陳玉鋒，莊志萍.紫外分光光度法測(cè)定橙汁中維生素C的含量[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(1)：236-237，240．

[20]馬宏飛，盧生有，韓秋菊，等.紫外分光光度法測(cè)定五種果蔬中維生素C的含量[J]．化學(xué)與生物工程，2012，29(8)：92-94．