HPLC法測定維吾爾藥材阿勃勒中指標(biāo)性成分的含量

鄭夢成，高 艷，郭 爽，孫如煜，杜守穎*，白 潔*，陳 菊

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，烏魯木齊 830000)

阿勃勒是豆科植物臘腸樹CassiafistulaL.的干燥成熟果實(shí)，現(xiàn)收載于《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》、《中國醫(yī)學(xué)百科全書維吾爾醫(yī)學(xué)卷》和《中華本草維吾爾卷》，異名為臘腸樹果和清瀉山扁豆[1-3]，是維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材。阿勃勒可生濕生熱、清除過剩黑膽汁、清熱消炎、潤腸通便和散氣通經(jīng)，常用于治療干寒或體液燒焦沉淀引起的黑膽汁性炎腫、目赤腫痛、喉干便秘、關(guān)節(jié)痛、干咳和氣喘等癥[1]，臨床常用于治療異常膽液質(zhì)所引起的便秘等癥，多見于傳統(tǒng)組方如通阻合牙日仙拜爾片、買提布合木來引湯和買提布合艾非提蒙湯等[2]。另外，阿勃勒在國外文獻(xiàn)、藏藥和傣藥中均有記載，在印度，阿勃勒主要用于治療皮膚病和保肝等，阿勃勒的原植物臘腸樹也被用于治療咳嗽、皮膚瘙癢和糖尿病等[4-5]；在藏藥理論中，阿勃勒具有清熱功效，能治療肝病、實(shí)熱便秘和四肢腫脹等，收載于藏族醫(yī)藥經(jīng)典《月王藥診》、《四部醫(yī)典》和《中國藏藥》[6]；阿勃勒在傣族藥典中被記載，主要用于抗菌和潤腸通便[7]。現(xiàn)代研究表明，阿勃勒中含蒽醌類(如大黃酸)、縮合性鞣質(zhì)等成分，種子中含有多種揮發(fā)性成分[8-11]。

目前，關(guān)于阿勃勒的研究相對匱乏，《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》中該藥項下僅有性狀和鑒別項，缺少必要的含量檢測項目，無法有效控制藥材質(zhì)量。原標(biāo)準(zhǔn)鑒別項目提示：阿勃勒中含有蒽醌類成分，這與其臨床用于治療便秘等癥的功效相契合，考慮阿勃勒中蒽醌類成分為其瀉下作用的主要藥效成分[8]，因此擬篩選含量較高的蒽醌類成分作為其含量測定的指標(biāo)成分；建立指標(biāo)性成分的含量測定方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)，為更全面地評價阿勃勒藥材及其相關(guān)制劑質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司，SPD-M20A，PDA檢測器，LC Solution色譜工作站)；BT 25S電子分析天平(北京賽多利斯公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 大黃酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110757-201607)；阿勃勒(批號160801，由新疆銀朵蘭維藥股份有限公司提供)，按照《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》、《中國藥典》2015年版四部檢驗(yàn)，符合規(guī)定；乙腈(Sigma公司，色譜級)；磷酸(TED公司，分析純)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；甲醇為分析純；其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1指標(biāo)性成分的篩選 參考《中國藥典》2015年版大黃項下[12]游離蒽醌及總蒽醌的提取方法，選擇蒽醌類代表性成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品進(jìn)行色譜圖比對。

2.1.1蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的色譜比對 色譜條件：Diamosil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-1 mL·L-1磷酸 (47∶53)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫為30℃，進(jìn)樣體積為20 μL。HPLC圖見圖1。

圖1蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素與阿勃勒樣品的HPLC對比圖

A.混合對照品；B.游離蒽醌樣品；C.總蒽醌樣品；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素。

Fig.1 Comparison of HPLC chromatograms of aloe-emodin，rhein，emodin and samples of Abole

A.mixed reference substances；B.sample of free anthraquinones；C.sample of total anthraquinones；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin.

2.1.2大黃酚和大黃素甲醚的色譜比對 色譜條件：Diamosil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-1 mL·L-1磷酸(57∶43)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。HPLC圖見圖2。

由圖1～2可知，阿勃勒游離蒽醌樣品及總蒽醌樣品中均可檢出大黃酸，而不可檢出其余4種，因此，確定大黃酸為阿勃勒中含量測定的指標(biāo)性成分。

2.2指標(biāo)性成分含量測定方法的建立

2.2.1色譜條件 Diamosil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-1 mL·L-1磷酸(47∶53)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。在上述色譜條件下進(jìn)行分析，大黃酸保留時間為15 min，分離度良好，色譜圖見圖3。

圖2大黃酚、大黃素甲醚與阿勃勒樣品的HPLC對比圖

A.混合對照品；B.游離蒽醌樣品；C.總蒽醌樣品；4.大黃酚;5.大黃素甲醚。

Fig.2 Comparison of HPLC chromatograms of chrysophanol，physcion and samples of Abole

A.mixed reference substances；B.sample of free anthraquinones；C.sample of total anthraquinones；4.chrysophanol；5.physcion.

圖3阿勃勒對照品、供試品和陰性對照品的HPLC圖

A.對照品；B.阿勃勒樣品；C.陰性對照；1.大黃酸。

Fig.3 HPLC chromatograms of Abole reference substance，sample and negative control

A.reference substance；B.sample of Abole；C.negative control；1.rhein.

2.2.2混合對照品溶液的制備 取大黃酸對照品0.84 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液的制備 取阿勃勒藥材，粉碎，過4號篩，稱取1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入100 mL甲醇，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.4陰性樣品溶液的制備 按照2.2.3項下方法制備阿勃勒陰性樣品溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密移取2.2.2項下制備的混合對照品溶液1 mL，分別置于2，5，10，25和50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，測定峰面積。按照2.2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。分別以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得大黃酸的回歸方程為y=72 308x-36 833 (r=0.999 8)，結(jié)果表明，大黃酸質(zhì)量濃度在1.68～84.00 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2精密度考察 按照2.2.1項下色譜條件，取2.2.2項下制備的混合對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，以大黃酸峰面積計算RSD值為0.29%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性考察 取2.2.3項下制備的阿勃勒供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件，在0，2，4，6，12和24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20 μL，測得大黃酸的峰面積RSD值為0.68%，結(jié)果表明，阿勃勒供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性考察 取同一批阿勃勒粉末6份，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20 μL，測得大黃酸的平均含量為0.335 6 mg·g-1，RSD值為1.52%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率考察 取已知含量的阿勃勒粉末0.5 g，精密稱定，加入一定量的大黃酸對照品溶液，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按照2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣，測定大黃酸的含量，計算平均回收率及RSD值，結(jié)果表明，大黃酸的平均加樣回收率為99.87%，RSD值為1.01%。見表1。

表1大黃酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of rhein recovery test

編號取樣量/g樣品中含量/mg加入對照品量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.50040.16790.18000.3485100.3299.871.0120.50010.16780.18000.347699.8730.50010.16780.18000.347899.9840.50010.16780.18000.344898.3450.50060.16800.18000.346899.3160.50070.16800.18000.3505101.38

2.4不同批次阿勃勒中大黃酸的含量測定 6批阿勃勒樣品均由新疆銀朵蘭維藥股份有限公司提供，按照《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》檢驗(yàn)，符合規(guī)定。精密稱取各批次阿勃勒粉末1 g，過4號篩，平行操作3份，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件測定大黃酸的含量，樣品采集信息及測定結(jié)果見表2。

表2樣品采集信息及測定結(jié)果

Tab.2 Sample collection information and determination results

(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法測定阿勃勒藥材中指標(biāo)性成分大黃酸的含量，線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、回收率均符合要求，該方法簡便易行，可為阿勃勒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.1含量測定指標(biāo)成分的篩選 現(xiàn)代研究表明，阿勃勒含蒽醌類成分，如大黃酸、蘆薈大黃素苷、甲氧基蒽醌及鞣質(zhì)等成分[1]。本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)行大黃酸等對照品比對，確定阿勃勒中蒽醌類成分為大黃酸，綜合考慮蒽醌類為其瀉下作用的藥效成分，最終選擇大黃酸作為其含量測定指標(biāo)性成分，并建立阿勃勒中大黃酸的含量測定方法。

3.2色譜條件的選擇 大黃酸在中藥材及中成藥中的含量測定方面已有眾多文獻(xiàn)報道[13-17]，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-0.5 mL·L-1磷酸、甲醇-1 mL·L-1磷酸和乙腈-1 mL·L-1磷酸，發(fā)現(xiàn)使用流動相為后者時雜質(zhì)干擾較少，分離度較好?？疾煲译?1 mL·L-1磷酸不同比例，最終選擇最佳比例為47∶53，此時色譜峰分離度好、保留時間適宜、線性關(guān)系和重復(fù)性良好。

3.3供試品溶液及其制備方法的考察 以大黃酸含量為指標(biāo)，對供試品溶液的制備方法進(jìn)行單因素考察，包括：提取方法(回流法、超聲法)，提取溶劑(體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇和甲醇)，提取溶劑用量(25，50，100和150 mL)，提取時間(0.5，1.0，1.5和2.0 h)以及藥材粉碎粒度(過3，4號篩)，通過SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最終確定最佳供試品溶液的制備方法。

3.4結(jié)果分析 在所測的6批阿勃勒藥材中，均能檢測到大黃酸，但產(chǎn)地、來源不同，含量差異明顯；同一產(chǎn)地不同批次藥材間大黃酸含量亦有較大差異，如第1批與第5批大黃酸含量相差約20%，推測阿勃勒的儲存條件等也會對其含量產(chǎn)生影響，這提示我們在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)注意采收時間、控制藥材儲存條件和藥材來源。本實(shí)驗(yàn)同時對阿勃勒不同部位的大黃酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，大黃酸主要存在于果殼中，種子中含量極少，同一果實(shí)中果殼中的大黃酸總量為種子中的265倍。種子中大黃酸含量雖少，但研究表明種子中含有脂肪油和樹膠等[2，10]，有潤下作用，與果實(shí)中所含的蒽醌類成分的瀉下作用相協(xié)調(diào)，具有潤腸通便作用，入藥時不必舍去。

本實(shí)驗(yàn)中僅檢測6個批次，各批次間差異較大，若要進(jìn)一步制定阿勃勒含量測定標(biāo)準(zhǔn)，則需積累一定批次，制定最低標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)相關(guān)制劑的過程中則需控制藥材來源。

維吾爾醫(yī)藥作為一個具有獨(dú)特實(shí)踐和理論的醫(yī)藥體系，是祖國醫(yī)藥不可缺少的部分，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究存在著化學(xué)研究起步較晚、相對落后的問題，限制了臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)[18-19]。目前，維吾爾藥材面臨著質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不健全甚至缺失的現(xiàn)狀，亟待提高標(biāo)準(zhǔn)[20]。阿勃勒作為維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材，臨床應(yīng)用廣泛，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究相對較少，《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》中僅有薄層鑒別項，無含量測定項，本實(shí)驗(yàn)綜合考慮含量測定結(jié)果與藥效作用，選擇大黃酸作為其含量測定指標(biāo)性成分，首次建立了阿勃勒中大黃酸的含量測定方法，該液相方法簡便、準(zhǔn)確，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善、臨床用藥安全、合理開發(fā)提供參考依據(jù)。

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