氣相色譜法測(cè)定遼藁本中藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞含量?

劉 晶，王光函，張 穎，曹宏偉，龐 敏△

(1. 遼寧中醫(yī)藥研究院, 沈陽(yáng) 110034； 2. 遼寧省疾病預(yù)防控制中心, 沈陽(yáng) 110000)

遼藁本為遼寧產(chǎn)道地藥材，在遼寧省清源縣有大面積人工栽培?！吨袊?guó)藥典》2015版記載，遼藁本為傘形科植物遼藁本LigusticumjeholenseNakaietKitag.的干燥根莖和根，其辛、溫，歸膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)、散寒、除濕、止痛之功效[1]，用于風(fēng)寒感冒、巔頂疼痛、風(fēng)濕痹痛。本研究采用氣相色譜法，建立遼藁本中藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞的含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7890 A氣相色譜儀(Agilent公司)，冷凍離心機(jī)(sigma公司), Aglient手動(dòng)進(jìn)樣器(Agilent公司)，F(xiàn)A1004電子天平。

1.2 對(duì)照品

藁本內(nèi)酯(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111737-201102)；正丁基苯酞(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-12121201)。

1.3 試劑

乙酸乙酯色譜純(Metedia)。

1.4 樣品來(lái)源

1號(hào)遼藁本樣品：遼寧省清源縣藥材種植基地；2號(hào)遼藁本樣品：遼寧省沈陽(yáng)市；3號(hào)遼藁本樣品：遼寧省鳳城縣，以上樣品經(jīng)鑒定為遼藁本。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液配制

精密稱取藁本內(nèi)酯對(duì)照品17.12 mg置于5 ml量瓶中，乙酸乙酯溶解、定容，得到3.424 mg·ml-1對(duì)照品母液，精密稱取正丁基苯酞對(duì)照品18.45 mg，置于5 ml量瓶中，乙酸乙酯溶解、定容，得到3.69 mg·ml-1對(duì)照品母液，從中精密吸取1 ml,置于10 ml量瓶中，乙酸乙酯定容，得到0.396 mg·ml-1對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液適量，配置一系列濃度的混合對(duì)照品。對(duì)照品母液保存于-20 ℃冰箱中，混合對(duì)照品溶液保存于-4 ℃冰箱中。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取遼藁本細(xì)粉約0.3 g置于具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯20 ml稱重，超聲30 min,乙酸乙酯補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻后10000 r·min-1離心5 min,取上清即得，供試品保存于-4 ℃冰箱中。

2.3 氣相色譜條件

圖1顯示， HP-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm Aglient公司)，分流不分流進(jìn)樣口:溫度250 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器:溫度300 ℃，H2：40 mL·min-1,空氣400 mL·min-1,流速1 mL·min-1,分流比10∶1，程序升溫條件：50 ℃，10 ℃·min-1至94 ℃，2 ℃·min-1至102 ℃， 5 ℃·min-1至130 ℃，2 ℃·min-1至144 ℃，0.5 ℃·min-1至145.5 ℃， 0.2 ℃·min-1至146.8 ℃，后運(yùn)行5 min至280 ℃。

圖1 遼藁本氣相色譜圖注：1.正丁基苯酞；2.藳本內(nèi)酯

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

圖2、3顯示，分別精密吸取上述對(duì)照品母液，配制不同濃度混合對(duì)照品溶液，精密吸取1-6號(hào)混合對(duì)照溶液1 μL注入氣相色譜儀，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程：藁本內(nèi)酯回歸方程Y=1510.3X-112.39，在 85.6～684.8μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9990；正丁基苯酞回歸方程Y=243.44X-8.5373，在 46.13～738μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9994。

圖2 藁本內(nèi)酯對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖3 正丁基苯酞對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 精密度考察

分別精密吸取線性測(cè)定項(xiàng)下的3號(hào)混合對(duì)照品溶液1 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞精密度RSD%分別為0.97%、0.84%，該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液1 μL，分別于0、0.5、1、2、4、8 h測(cè)定其峰面積，考察溶液的穩(wěn)定性，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞8 h穩(wěn)定性RSD%分別為1.97%、1.44%，該方法8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性

表1顯示，精密稱取遼藁本細(xì)粉約0.3 g共6份，置于具塞錐形瓶中，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL注入氣相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞重復(fù)性RSD%分別為1.57%、1.32%，該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞含量的樣品共6份，置于具塞錐形瓶中，精密加入藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞對(duì)照品適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取上述溶液1 μL注入氣相色譜儀，測(cè)定峰面積計(jì)算回收率。藁本內(nèi)酯平均回收率101.34%，RSD%1.87%，正丁基苯酞平均加樣回收率98.45%，RSD%1.62%，該方法加樣回收率合格。

2.9 樣品的含量測(cè)定

表1顯示，取遼藁本藥材細(xì)粉3批，分別精密稱取約0.3 g(n=2)，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 μL 注入氣相色譜儀，同時(shí)精密吸取3號(hào)混合對(duì)照品溶液1 μL注入氣相色譜儀，計(jì)算測(cè)定3批樣品含量。

表1 藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞加樣回收率

表2 3批遼藁本樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

遼藁本中含有大量揮發(fā)性成分，為其主要有效成分，其中含有的藁本內(nèi)酯為苯酞類成分，具有一定鎮(zhèn)痛作用，對(duì)急慢性炎癥有明顯抑制作用[2]，能通過(guò)激動(dòng)PPARγ抑制TLR4/NF-kB信號(hào)通路的活化從而發(fā)揮抗炎作用[3]，能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)外炎癥反應(yīng)[4]，能夠保護(hù)OGD-R損傷的人臍靜脈內(nèi)皮血管細(xì)胞，抑制細(xì)胞氧化損傷，調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能[5]。正丁基苯酞是遼藁本抗炎有效成分之一，能夠抑制缺血后組織花生四烯酸和磷脂酶A2基因的表達(dá)[6]，降低炎癥區(qū)域腫瘤壞死因子和細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)[7]，誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)HSP70的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用[8]，對(duì)LPS刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞，能夠抑制NO的釋放，提高神經(jīng)元存活率[9]。腦梗死后給予正丁基苯酞進(jìn)行干預(yù)，可以改善神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，上調(diào)shh/Ptch1/Glil和BDNF表達(dá)水平，對(duì)腦缺血后腦組織神經(jīng)可塑性具有保護(hù)作用[10]。故本研究采用氣相色譜法，建立遼藁本中有效成分藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞含量測(cè)定方法，為遼藁本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)。

本研究同時(shí)測(cè)定遼藁本藥材中藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞含量，其方法簡(jiǎn)便，操作性好，為遼藁本的質(zhì)量控制提供了一種新的方法。在色譜條件的確定過(guò)程中，考察過(guò)HP-5MS、HP-225、DB-17等多種不同極性氣相色譜柱，根據(jù)最終分離效果采用HP-5MS進(jìn)行分離。在本實(shí)驗(yàn)程序升溫條件下，遼藁本中成分多數(shù)可以達(dá)到基線分離，可進(jìn)行進(jìn)一步指紋圖譜研究。

文獻(xiàn)報(bào)道，藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性較差，常溫保存易發(fā)生多種異構(gòu)化，純品在-20 ℃可長(zhǎng)時(shí)間保存，溶于氯仿-20 ℃保存比較穩(wěn)定，溶于乙醇30 d降解較多[11]。故本研究根據(jù)藁本內(nèi)酯這一特性，對(duì)照品母液保存于-20 ℃冰箱中，混合對(duì)照品和供試品每日重新制備，-4 ℃保存。穩(wěn)定性考察僅考察8 h，每日實(shí)驗(yàn)均在8 h內(nèi)完成。

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