鐵線蓮‘Blekitny Aniol’組織培養(yǎng)及再生體系建立

黃 鑫，張彥妮(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

鐵線蓮屬(Clematis)隸屬于毛茛科(Ranunculaceae)，多為木質(zhì)藤本，少數(shù)為草本、灌木或亞灌木，是國(guó)際上著名的觀賞花卉，除南極洲以外，全世界各地均有分布[1]。鐵線蓮莖韌如鐵線，花開(kāi)如蓮，花型新穎，花色從單一到復(fù)合、漸變幾乎囊括了所有常見(jiàn)的色彩，花量大，花期長(zhǎng)[2]。覆蓋率和生長(zhǎng)速度上表現(xiàn)較好，可以做立體裝飾，也可以應(yīng)用于地被、盆花、切花中自成一景，被譽(yù)為“藤本植物皇后”。在歐美國(guó)家，鐵線蓮的栽培育種歷史悠久，園藝品種已經(jīng)在3 000種以上，多應(yīng)用在植物園、公園、庭院的廊架綠亭、墻面、地表以構(gòu)成獨(dú)立的景觀。每年5月英國(guó)切爾西園藝展都會(huì)展出鐵線蓮方面頂尖的園林作品，鐵線蓮也常作為國(guó)宴擺花[3]。在國(guó)內(nèi)，鐵線蓮尚屬新興品種，大規(guī)模的新優(yōu)品種多源于歐洲，中國(guó)科學(xué)院植物研究所北京植物園和上海植物園已經(jīng)批量引種并開(kāi)展研究，這也反映了鐵線蓮逐步擴(kuò)大的市場(chǎng)需求和廣闊的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，關(guān)于鐵線蓮的研究主要集中于藥理分析和區(qū)域性種質(zhì)資源調(diào)查方面，而對(duì)于新品種培育和栽培繁殖方面的研究相對(duì)較少[4]。鐵線蓮屬是中醫(yī)臨床常用的清熱解毒或祛風(fēng)除濕類藥物，其中提取出的皂苷及木脂素類成分，具有一定的抑制腫瘤活性作用[5]。由于鐵線蓮栽培品種結(jié)實(shí)少、多為不可育種子，發(fā)芽率低，故生產(chǎn)中通常采用扦插和壓條繁殖，但繁殖系數(shù)也較低，生長(zhǎng)緩慢，難以滿足市場(chǎng)要求[6]。而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅可以提高繁殖速度，還可保持植物優(yōu)良的觀賞特性[7]。為了將優(yōu)良品種更好地推廣到園林應(yīng)用上，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了相應(yīng)的研究：張啟香等[8]以栽培品種(C.florida‘MultiBlue’)的幼葉、莖尖、嫩莖為外植體，其中通過(guò)莖尖誘導(dǎo)出的愈傷組織可以形成胚性愈傷組織，培育周期為10個(gè)月；袁迎燕等[9]以毛蕊鐵線蓮(C.lasiandra)為材料，通過(guò)帶芽莖段獲得再生植株；Mitrofanova等[10]對(duì)不同外植體獲得的鐵線蓮植株的分子遺傳異質(zhì)性進(jìn)行了研究。目前對(duì)于鐵線蓮組織培養(yǎng)方面的研究仍處在探索階段，對(duì)于不同品種的鐵線蓮，再生途徑差異較大，還需要不斷探索和完善[10]。

本研究以鐵線蓮品種Blekitny Aniol(由波蘭引進(jìn)的晚花大花型栽培品種)為研究對(duì)象，以葉片、莖段和帶芽莖段為外植體，通過(guò)愈傷組織或不定芽分化途徑，旨在成功建立該品種的組織培養(yǎng)再生體系，為其推廣應(yīng)用提供理論和實(shí)踐參考，也為其他鐵線蓮屬植物引種和開(kāi)發(fā)利用奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自栽植于東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院花卉研究所的盆栽鐵線蓮品種Blekitny Aniol，選取其當(dāng)年生枝條上的葉片、莖段和帶芽莖段作為供試材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體處理及消毒 于3、4月份在天氣晴朗的狀態(tài)下剪取當(dāng)年生長(zhǎng)健壯的嫩莖10 cm左右，莖和葉分開(kāi)，自來(lái)水沖去表面塵垢，在加洗潔精溶液浸泡10 min后用流水漂洗15 min，放入無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精清洗10 s后用無(wú)菌水沖洗3遍，然后在1%的NaClO溶液中分別浸泡3、5、7 min，再次用無(wú)菌水沖洗3～5遍，在滅菌的濾紙上吸干表面水分。將葉片切成約1 cm×1 cm，莖段和帶芽莖段切成1 cm左右，接種于各類培養(yǎng)基上。每處理20個(gè)外植體，重復(fù)3次。14 d后分別統(tǒng)計(jì)不同消毒時(shí)間的污染率、褐化率和存活率，篩選出外植體最佳的消毒時(shí)間。

1.2.2帶芽莖段腋芽的誘導(dǎo) 將消毒后的帶芽莖段接種在MS基本培養(yǎng)基上，分別添加不同濃度的6-BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)、NAA(0.01、0.05、0.10 mg·L-1)，進(jìn)行二因素三水平的正交試驗(yàn)。每處理接種20個(gè)外植體，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率、平均腋芽數(shù)和生長(zhǎng)狀況。

1.2.3葉片、莖段愈傷組織的誘導(dǎo) 將處理后的葉片和莖段接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)、NAA(0.01、0.05、0.10 mg·L-1)組合成二因素三水平正交試驗(yàn)。每處理接種20個(gè)外植體，3次重復(fù)。30 d后分別統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率并記錄生長(zhǎng)情況。

1.2.4愈傷組織不定芽的分化 將誘導(dǎo)出生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織分別轉(zhuǎn)接到不同組合的分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的分化，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(1、2、3 mg·L-1)、NAA(0.01、0.05、0.10 mg·L-1)組成二因素三水平試驗(yàn)。每種處理20個(gè)外植體，3次重復(fù)。30 d后分別統(tǒng)計(jì)不定芽分化率及平均不定芽數(shù)。

1.2.5芽的增殖培養(yǎng) 將由愈傷組織分化而來(lái)的不定芽和由帶芽莖段直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的腋芽接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，選擇上面不定芽分化率高的培養(yǎng)基作為增殖培養(yǎng)基，每種處理20個(gè)外植體，3次重復(fù)。30 d后記錄增殖芽數(shù)，計(jì)算增殖倍數(shù)。

1.2.6組培苗的生根誘導(dǎo) 將生長(zhǎng)良好、高1～2 cm的不定芽(具有1～2對(duì)新生葉片)轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，以1/2MS和MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA(0.05、0.1、0.5 mg·L-1)。每個(gè)處理10瓶，每瓶1株，重復(fù)3次，定期觀察并記錄生根情況。40 d后統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)。以上所有培養(yǎng)基均附加2.5%蔗糖、0.75%瓊脂，pH 5.8～6.0。培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光周期為16 h·d-1。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

污染率=(污染的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù))×100%；

褐化率=(褐化的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù))×100%；

存活率=(存活的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù))×100%；

第一種思路：大多數(shù)的學(xué)者認(rèn)為中國(guó)共產(chǎn)黨生態(tài)文明思想是經(jīng)歷了以毛澤東、鄧小平、江澤民、胡錦濤為核心的黨的四代中央領(lǐng)導(dǎo)集體不斷探索、繼承、豐富、發(fā)展和創(chuàng)新的過(guò)程逐漸形成的。

腋芽萌發(fā)率=(腋芽萌發(fā)的外植體個(gè)數(shù)/存活的外植體個(gè)數(shù)) ×100%；

愈傷誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%；

愈傷分化率=(已分化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù))×100%；

不定芽增殖倍數(shù)=增殖后的有效芽數(shù)/接種時(shí)的腋芽數(shù)；

生根率=(生根的幼苗數(shù)/接種幼苗總數(shù))×100%。

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體消毒時(shí)間的篩選

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同消毒時(shí)間對(duì)不同外植體的污染率、褐化率及存活率影響存在差異(表1)。當(dāng)莖段和帶芽莖段在消毒時(shí)間為7 min時(shí)，其污染率較低，分別為16.67%和14.44%，存活率較高，分別為78.89%和84.45%，與其他兩組消毒時(shí)間相比差異顯著(P<0.05)；葉片消毒5 min時(shí)，與消毒7 min相比，污染率和成活率差異不顯著(P>0.05)，但褐化率顯著降低，與消毒3 min相比，其污染率顯著降低，存活率有所提高。因此，莖段和帶芽莖段最佳消毒時(shí)間為7 min，葉片最佳的消毒時(shí)間為5 min。

表1 次氯酸鈉處理時(shí)間對(duì)鐵線蓮‘Blekitny Aniol’不同外植體的消毒效果的影響Table 1 Effect of different durations of sterilization on sterilization efficiency of different explants of ‘Blekitny Aniol’

表中數(shù)值是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values are expressed as the mean±SE. Different lowercase letters within the same column indicate significant differences at the 0.05 level, similarly for the following tables.

2.2 不同激素濃度對(duì)帶芽莖段腋芽萌發(fā)的影響

帶芽莖段接種到初代培養(yǎng)基上，7 d后腋芽開(kāi)始有不同程度的萌發(fā)(表2)。方差分析表明，不同濃度6-BA對(duì)帶芽莖段腋芽誘導(dǎo)影響差異顯著(P<0.05)，NAA對(duì)其影響不顯著(P>0.05)。隨著6-BA濃度上升，誘導(dǎo)率隨之上升，7、8、9號(hào)培養(yǎng)基平均腋芽數(shù)均較高，但植株長(zhǎng)勢(shì)不佳，新葉枯黃。在4號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基中，無(wú)菌苗生長(zhǎng)健壯，葉片舒展(圖1A)，其中5號(hào)培養(yǎng)基萌發(fā)率最高。因此，最適宜帶芽莖段腋芽萌發(fā)的初代培養(yǎng)基為MS+1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA。

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

2.3.1不同激素濃度對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將莖段接種到不同培養(yǎng)基中，10 d后莖段兩端膨大，呈啞鈴狀，開(kāi)始形成愈傷組織。7號(hào)和8號(hào)培養(yǎng)基愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較好(圖1B)，誘導(dǎo)率較高，分別為78.3%和70.0%(表3)。說(shuō)明高濃度的6-BA與低濃度的NAA組合使用有利于莖段誘導(dǎo)愈傷組織，隨著NAA濃度上升，愈傷組織變得致密。根據(jù)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度宜低不宜高的原則[11]，誘導(dǎo)莖段愈傷組織的最適培養(yǎng)基為7號(hào)：MS+2 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA。

2.3.2不同濃度激素對(duì)葉片愈傷組織的影響 葉片在培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，邊緣卷曲加厚，切口處開(kāi)始膨大，10～15 d時(shí)，大多數(shù)處理都產(chǎn)生了愈傷組織，少部分葉片出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。高濃度的NAA(0.1 mg·L-1)和中濃度的6-BA(1 mg·L-1)組合使用時(shí)，誘導(dǎo)率最高為81.7%(表4)。該培養(yǎng)基(6號(hào))與其他培養(yǎng)基之間存在顯著差異(P<0.05)，愈傷組織生長(zhǎng)狀況最佳(圖1C)。因此，葉片誘導(dǎo)愈傷最適宜的培養(yǎng)基為6號(hào)：MS+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。

2.4 不同濃度激素對(duì)愈傷組織分化的影響

將由莖段和葉片誘導(dǎo)得到的長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織分別接種到分化培養(yǎng)基上，以1/2MS為基本培養(yǎng)基。大部分愈傷組織沒(méi)有分化(表5)，但出現(xiàn)了增殖現(xiàn)象(圖1D)，愈傷組織變得致密，內(nèi)部出現(xiàn)空腔。多次繼代后，只有在6號(hào)和9號(hào)培養(yǎng)基上分化出了不定芽，不定芽長(zhǎng)勢(shì)較好，葉片綠色(圖1E、F)，其中6號(hào)培養(yǎng)基的分化率較高。綜上所述，誘導(dǎo)愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為6號(hào)：1/2MS+3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA。

表2 不同激素配比對(duì)鐵線蓮‘Blekitny Aniol’帶芽莖段誘導(dǎo)腋芽的影響Table 2 Effect of various hormone concentrations on callus induction from cotyledon node of ‘Blekitny Aniol’

表3 不同濃度激素對(duì)鐵線蓮‘Blekitny Aniol’莖段誘導(dǎo)愈傷組織的影響Table 3 Effect of various hormone concentrations on callus induction from stem of ‘Blekitny Aniol’

圖1 鐵線蓮‘BlekitnyAniol’組織培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)期的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig. 1 Growth status of ‘Blekitny Aniolat’ different stages of tissue culture

表4 不同濃度激素對(duì)鐵線蓮‘Blekitny Aniol’葉片誘導(dǎo)愈傷的影響Table 4 Effect of various hormone concentrations on callus induction from leaf blade of ‘Blekitny Aniol’

2.5 芽的增殖培養(yǎng)

將愈傷組織分化而來(lái)的不定芽和帶芽莖段直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的腋芽接種到增殖培養(yǎng)基上，以1/2MS為基本培養(yǎng)基。15 d后開(kāi)始有叢生芽萌發(fā)，20 d后叢生芽生長(zhǎng)旺盛。可以看出， NAA濃度上升，有助于芽的增殖(表6)。2號(hào)培養(yǎng)基更適宜芽的增殖，增殖倍數(shù)達(dá)4.94，生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1G)。因此,最適宜芽增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+3 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。

表5 不同濃度激素對(duì)鐵線蓮‘Blekitny Aniol’愈傷組織分化的影響Table 5 Effect of various hormone concentrations on callus differentiation of ‘Blekitny Aniol’

表6 不同濃度激素對(duì)鐵線蓮‘Blekitny Aniol’芽增殖的影響Table 6 Effect of various hormone concentrations on bud proliferation of ‘Blekitny Aniol’

2.6 不同培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽生根的影響

將高1～2 cm的不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，分別以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，22 d后開(kāi)始有新根產(chǎn)生。培養(yǎng)基類型和激素濃度對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)都有顯著影響(P<0.05)，1/2MS培養(yǎng)基明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基(表7)。以MS為基本培養(yǎng)基的3種處理中，當(dāng)NAA濃度為0.05 mg·L-1時(shí)，3項(xiàng)指標(biāo)分別達(dá)到最高；以1/2MS為基本培養(yǎng)基的3種處理中，低濃度的NAA有利于提高生根率和平均根長(zhǎng)，根系生長(zhǎng)健壯(圖1H)，但是對(duì)平均生根數(shù)有抑制作用。綜合數(shù)據(jù)分析，最適宜的生根培養(yǎng)基組合為1/2MS+0.05 mg·L-1NAA。

表7 不同培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)鐵線蓮‘Blekitny Aniol’不定芽生根的影響Table 7 Effect of different culture media and combinations of plant growth regulators on rooting of adventitious buds of ‘Blekitny Aniol’

3 討論與結(jié)論

鐵線蓮植株表面絨毛多，易附著病原菌，增加了消毒難度[12]。升汞是目前鐵線蓮組織培養(yǎng)中應(yīng)用較廣泛的消毒劑，但是通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，升汞對(duì)外植體損傷較大，同時(shí)產(chǎn)生有毒廢液，用后必須回收處理，因此選用次氯酸鈉進(jìn)行滅菌，效果較好，并且環(huán)保無(wú)污染。葉片消毒時(shí)間為5 min，莖段和帶芽莖段消毒時(shí)間為7 min，需要分開(kāi)處理。葉片長(zhǎng)時(shí)間消毒，褐化率上升，但是對(duì)莖段和帶芽莖段的影響不大，說(shuō)明不同外植體對(duì)消毒劑的反應(yīng)強(qiáng)度不同，本研究也發(fā)現(xiàn)葉片的薄厚、莖段的粗細(xì)會(huì)影響消毒效果，葉片較厚、莖段較粗的外植體污染率較低(數(shù)據(jù)未給出)。

植物激素的配比在組織培養(yǎng)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，在一定濃度范圍內(nèi)，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比值控制著植物形態(tài)建成的發(fā)展方向[13]。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比值低時(shí)有助于芽的生長(zhǎng)，比值高則有助于根的發(fā)生[14]。二者常用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化，在本研究中，對(duì)于鐵線蓮的帶芽莖段直接誘導(dǎo)腋芽，在培養(yǎng)基MS+1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA上腋芽萌發(fā)率最高為100%，而且苗節(jié)數(shù)多，葉色濃綠。因此是帶芽莖段誘導(dǎo)腋芽最佳培養(yǎng)基，這和臧文靜等[15]在雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureum)上的研究結(jié)果一致。在對(duì)鐵線蓮葉片和莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同部位的外植體在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)存在顯著差異(P<0.05)，這可能跟外植體本身所包含的內(nèi)源激素種類、濃度有關(guān)，也可能是不同外植體出愈能力有所區(qū)別[16]。對(duì)于莖段，較高濃度的6-BA結(jié)合較低濃度的NAA有助于愈傷組織的誘導(dǎo)，愈傷組織表面呈現(xiàn)顆粒狀，顏色為黃綠色，質(zhì)地疏松，當(dāng)兩種激素濃度均較高時(shí)，愈傷組織逐漸褐化，以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織最適宜培養(yǎng)基為MS+2 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA。對(duì)于葉片，過(guò)高或者過(guò)低濃度的6-BA都不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，葉片容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，當(dāng)6-BA濃度為1 mg·L-1時(shí)，配合著較高濃度的NAA可以產(chǎn)生疏松的愈傷組織，通過(guò)葉片誘導(dǎo)愈傷組織最適宜的培養(yǎng)基為MS+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷出現(xiàn)褐化的原因可能是由于組織細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)的積累對(duì)外植體產(chǎn)生了毒害作用，也可能與細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)化合物的含量活性有關(guān)[17-18]。通過(guò)縮短繼代周期和添加0.1 g·L-1的活性炭，可以不同程度地降低褐化率，其中縮短繼代周期防止褐化的效果相對(duì)較好。

在鐵線蓮愈傷組織分化過(guò)程中，較高濃度的6-BA有助于愈傷組織的分化，而較高濃度的NAA對(duì)愈傷組織的分化有一定的抑制作用，這也符合根芽形成的激素控制理論，這與董玉玲等[19]對(duì)木本油料作物美藤果(Plukenetiavolubilis)誘導(dǎo)不定芽的研究結(jié)論相似。高濃度的6-BA促進(jìn)愈傷組織分化，但是隨著濃度的增加，褐化率也有上升的趨勢(shì)，可能是由于外源6-BA的積累并促進(jìn)愈傷組織內(nèi)部的激素合成，從而提高了內(nèi)部激素的總體水平，激素間的比值發(fā)生變化[20-22]。降低NAA的濃度和縮短繼代時(shí)間都可以不同程度的緩解褐化，繼代時(shí)間縮短為15 d效果較顯著(P<0.05)。分化培養(yǎng)基為1/2MS+3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA時(shí)，分化率最高為25%，出芽數(shù)為2.6。6個(gè)月后分化出不定芽，愈傷組織多呈現(xiàn)小塊松散狀，其余大部分愈傷組織形態(tài)呈綠色致密顆粒，部分表面有白點(diǎn)，內(nèi)部出現(xiàn)空腔和導(dǎo)管等結(jié)構(gòu)，喪失了分化能力，少部分逐漸褐化死亡。這與其他研究人員對(duì)鐵線蓮愈傷分化研究的結(jié)論相似，如Mandergara和Sieber[23]以C.interifolia×C.viticella的莖段為外植體通過(guò)18個(gè)月的培養(yǎng)獲得了體細(xì)胞胚，隨后在為期兩年的觀察中，體細(xì)胞胚有少部分分化出不定芽。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于鐵線蓮?fù)ㄟ^(guò)愈傷途徑分化不定芽的研究成果相對(duì)較少，張啟香等[24]以栽培品種MultiBlue的莖尖為外植體進(jìn)行培養(yǎng)獲得了由愈傷組織分化的再生植株。在芽的增殖方面，本研究在1/2MS+3 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上，增殖倍數(shù)高達(dá)4.94，芽明顯變細(xì)長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)健壯。

在生根培養(yǎng)中，基因型是影響植株再生的主要因素之一，里昂城鐵線蓮的生根率為93.33%，鈍齒鐵線蓮的生根率為69.4%[25-26]，本研究中Blekitny Aniol的生根率為70.2%。生根率不同主要與品種不同有關(guān)。在培養(yǎng)基類型比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基中組培苗的各項(xiàng)根系指標(biāo)均顯著高于MS培養(yǎng)基(P<0.05)，這與鐵線蓮Crystal Fountain和Gipsy Queen的研究結(jié)果相一致[7,27]，但與薄葉鐵線蓮(C.gouriana)和全緣鐵線蓮(C.interifolia)×意大利鐵線蓮(C.viticella)的研究結(jié)果[28]有所不同，前者通過(guò) MS作為唯一選用的培養(yǎng)基類型，得到完整植株,后者通過(guò)液體培養(yǎng)56 d也開(kāi)始生根，可能是由于培養(yǎng)基中不同濃度的鹽類成分對(duì)研究對(duì)象影響有差異[23-24]，其中降低氮元素和提高磷元素對(duì)植株生根可能產(chǎn)生促進(jìn)作用[29]。本研究表明，較低濃度的NAA有利于根的發(fā)生，但是會(huì)延長(zhǎng)生根時(shí)間，當(dāng)NAA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，接種22 d后開(kāi)始生根，隨之產(chǎn)生的愈傷組織較大，不利于后期移栽；當(dāng)NAA為0.05 mg·L-1時(shí)，30 d后開(kāi)始生根，雖然生根時(shí)間較晚，但是愈傷組織最小，生根率最高。因此，本研究認(rèn)為培養(yǎng)基1/2MS+0.05 mg·L-1NAA最適合組培苗的生根培養(yǎng)。

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