纖維素分解菌與乳酸菌復合發(fā)酵條件的響應曲面優(yōu)化分析

張凡凡,苗 芳,王旭哲,唐開婷,馬春暉(石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000)

響應曲面優(yōu)化法(response surface methodology,RSM)是一種實驗條件優(yōu)化的方法，適宜解決各類非線性數據處理的相關問題。其主要優(yōu)勢在于可對實驗水平進行連續(xù)的分析，而不是僅對孤立的實驗點進行，所以具有普通正交實驗方法無法比擬的優(yōu)越性[1]。且此方法因研究的關系簡單(各因子間、因子與響應值間)、省時準確等，所以常被認為是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、解決生產過程中實際問題的一種最為有效的方法，已被廣泛地應用于各個領域[2-3]。當前，采用響應曲面分析法主要是對發(fā)酵工藝參數和條件等進行優(yōu)化，而少見利用此方法優(yōu)化青貯玉米外源添加菌種量和比例的相關研究。

青貯玉米原料附著多種微生物，其中有益微生物主要為同型或異性發(fā)酵乳酸菌，有害微生物多以真菌為主[4]。也有研究表明，某些真菌作為青貯添加劑添加，其不僅不會破壞原有的發(fā)酵過程，且可有效降低發(fā)酵底物的纖維素含量[5-7]。其中黑曲霉(Aspergillusniger)作為我國農業(yè)部和美國FDA認證的安全菌種，可產生活性較高的多種胞外酶，適合飼用復合酶的固體發(fā)酵[8]。綠色木霉(Trichodermaviride)作為自然界中普遍存在的真菌，其不但可以產生多種具有生物活性的酶系，且對植物病理生物防治具有重要的作用[9]。此外，某些細菌如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產菌[10]，具有抑制大腸桿菌、沙門氏菌生長，以及對植物病原真菌的溶菌等作用[11-12]。此外，上述菌種產生的酶系(糖化酶、纖維素酶、木聚糖酶等多種胞外酶)可將發(fā)酵底物中的多糖降解為寡糖和單糖，一方面可為菌體生長提供豐富的營養(yǎng)底物[5]，另一方面對于青貯原料，可顯著降低發(fā)酵體系內銨態(tài)氮和總氮的比值、中/酸性洗滌纖維含量、丁酸與總酸的比值，并大幅抑制了青貯有害微生物的生長[13-15]。以往諸多研究均表明，酶系是否在青貯中發(fā)揮作用既要控制青貯發(fā)酵的環(huán)境[16]，也要充分考慮發(fā)酵菌種間的協(xié)同性。因此控制這些微生物的合理繁殖是調制優(yōu)質青貯的重要前提之一。鑒于此，本研究擬采用響應曲面法，探究外源添加劑同、異型發(fā)酵乳酸菌和纖維素分解菌菌群(黑曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌)復合發(fā)酵的理論最佳發(fā)酵比例和劑量，為青貯玉米發(fā)酵提質降耗的理論研究提供基礎，并為我國新型青貯添加劑的開發(fā)提供依據。

1 試驗材料與方法

1.1 主要材料

本研究主要菌種為購自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China,ACCC)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,ACCC 11016)、戊糖片球菌(Pediococcusacidilactici,ACCC 05481)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,ACCC 19374)、黑曲霉(Aspergillusniger,ACCC 30134)和綠色木霉(Trichodermaviride,ACCC 30595)。購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)的布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri,CICC 20293)。

1.2 試驗設計

通過查閱關于添加同、異型發(fā)酵乳酸菌(LAB)發(fā)酵青貯玉米的相關文獻，初步確定兩類LAB的添加量[17]為1×105、3×105和5×105cfu·g-1(即5、5.48、5.70 lg cfu·g-1)，其中同型發(fā)酵乳酸菌為植物乳桿菌和戊糖片球菌等比例混合(菌種數量比為1∶1)的復合菌，異型發(fā)酵LAB為布氏乳桿菌。纖維素分解菌菌群的添加比例為，黑曲霉∶綠色木霉∶枯草芽孢桿菌分別為1∶1∶2、1∶2∶1和2∶1∶1，添加量分別為0.1、0.2和0.3%[5-6]。然后進行響應曲面分析，優(yōu)化各菌種比例和添加量。

1.3 指標測定及方法

將各個菌種復壯后，接種至選擇性培養(yǎng)基中擴繁，其中LAB采用MRS液體培養(yǎng)基[配方：酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸鎂0.2 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 L，pH (6.2±0.2)]，真菌Aspergillusniger、Trichodermaviride采用PDA液體培養(yǎng)基(配方：馬鈴薯提取液1 L，葡萄糖20.0 g，自然pH)，Bacillussubtilis采用LB培養(yǎng)基(配方：酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0±0.2)。然后進行響應曲面優(yōu)化，設計方法為BBD(box-behnken design)，本研究中響應值為LAB和真菌的數量，自變量分別為同型發(fā)酵LAB添加量、異型發(fā)酵LAB添加量、纖維素分解菌菌群比例和劑量，分別以A、B、C和D代表，每個自變量的3個試驗水平(低、中、高)編碼分別為-1、0、1(表1)。然后將各個擴繁后的菌液按照BBD設計的添加比例和量進行混合，厭氧培養(yǎng)3 d后(35 ℃，pH 4.5)測定液體培養(yǎng)基中LAB和真菌的數量，具體采用傳統(tǒng)菌種計數法計數[18]，每個梯度做3個重復。取菌落數在30～300的平板作為有效計數板，菌落以肉眼可見為準，每克鮮樣(FM)中微生物的數量，即菌落形成單位(cfu)，計算方法為：

微生物數量=菌落數×稀釋倍數×1 000/涂布吸樣量。

1.4 數據統(tǒng)計分析

數據的初步整理和統(tǒng)計采用Microsoft Excel 2011軟件。采用Design Expert軟件進行響應曲面優(yōu)化，設通過最小二乘法擬合的二次多項式模型為：

式中:Y為預測響應值，即LAB或真菌數量的預測值；xi和xj為自變量的編碼值，c0為常數項，ai為線性系數，bij為二次項系數，n為因子數(n=4)。按照BBD試驗設計的統(tǒng)計學要求對二次多項式中各試驗進行回歸擬合，擬合后獲得回歸方程，運用軟件中自帶功能，選取兩個預測值均為最大(Y1為LAB，Y2為真菌數量)，以此得到最佳的各水平編碼值，最終計算求得各個變量的最佳組合[1-2]。

2 結果與分析

2.1 模型建立與顯著性檢驗分析

采用BBD設計得到變量代碼，按照變量代碼進行試驗，結果測得LAB最大值為9.96 lg cfu·g-1，其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D)；最小值為7.93 lg cfu·g-1，其代碼為-1(A)、0(B)、-1(C)、0(D)，總體平均值為8.63 lg cfu·g-1，總體標準差(SD)為0.16，變異系數(CV)為1.89%。真菌測得最大值為5.23 lg cfu·g-1，其代碼為0(A)、1(B)、0(C)、1(D)；最小值為3.92 lg cfu·g-1，其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D)，總體平均值為4.49 lg cfu·g-1，總體SD為0.27，CV為6.05%(表2)。

表1 試驗因素與編碼水平Table 1 The test factors and the coding level

纖維素分解菌依次為黑曲霉、綠色木霉和枯草芽孢桿菌。

Cellulose decomposing bacteria areAspergillusniger,TrichodermavirideandBacillussubtilis.

表2 Box-behnken試驗設計及乳酸菌和真菌的實際值Table 2 The actual value of lactic acid bacteria and fungi and box-behnken experiment design

利用Design Expert軟件，將表2的Y1和Y2數據按二次多項式模型進行多元回歸擬合，獲得Y1和Y2對編碼自變量A、B、C和D的二次多項回歸方程(表3)：

Y1=8.56+0.50A+0.50B+0.07C+0.04D+0.09A2+0.11B2-0.01C2-2.58×10-3D2+0.21AB+0.06AC-0.04AD-0.04BC-0.06BD+0.08CD；

Y2=4.38-0.02A-0.05B-8.33×10-3C+0.32D-3.58×10-3A2-0.04B2-0.03C2+0.35D2-0.17AB+0.30AC-0.01AD-0.18BC+0.18BD-0.04CD。

表3 乳酸菌和真菌數量的回歸方程系數及其顯著性檢驗Table 3 The regression equation coefficient and significance test of lactic acid bacteria and fungi number

2.2 復合發(fā)酵真菌和乳酸菌數量的響應曲面分析

通過對Y1所繪制的響應曲面圖及等高線圖可知(圖1)，A和B兩個因素的交互對Y1影響最大，當A和B的代碼越接近于1，Y1的值越趨于最大值(9.96 lg cfu·g-1)。A和C、D因素的交互作用中，起主要作用的均為因素A。B和C、D因素的交互作用中，起主要作用的均為因素B。C和D兩個因素的交互對Y1的值基本無影響(P=0.36)?？傮w來看，僅A和B因素的交互作用影響顯著(P=0.02)，其余兩因素的交互作用對Y1的值影響均不大(P>0.05)(表3)。通過對Y2所繪制的響應曲面圖及等高線圖可知(圖2)，對Y2的值起主要作用的為因素D，且因素D和其他因素的交互作用中因素D也也起到主要作用，但總體來看，除A、B因素交互作用外，其余各因素之間的交互作用對Y2的值影響均不大(P>0.05)(表3)。

圖1 4個因素兩兩交互作用影響乳酸菌數量的曲面圖及等高線圖Fig. 1 Surfaces charts and contour maps of lactic acid bacteria number on interaction with four factors

Y1表示乳酸菌數量，A為同型發(fā)酵乳酸菌添加量代碼，B為異型發(fā)酵乳酸菌添加量代碼，C為纖維素分解菌比例代碼，D為纖維素分解菌添加量代碼。下同。

Y1is the lactic acid bacteria number. A is the quantity of homofermentative lactic acid bacteria. B is the quantity of heterofermentative lactic acid bacteria. C is the quantity of cellulose decomposing bacteria proportion. D is the quantity of cellulose decomposing bacteria concentration; similarly for the following figures.

圖2 4個因素兩兩交互作用影響真菌數量的曲面圖及等高線圖Fig. 2 Surfaces charts and contour maps of fungi number on interaction with four factors

Y2表示真菌數量.

Y2is the fungi number.

最終利用軟件求出Y1和Y2均為最大值的代碼解(最優(yōu)解)為A=1.000，B=0.853，C=1.000，D=0.996，將代碼解換算成實際自變量可得，同型發(fā)酵LAB添加量為5×105cfu·g-1(5.70 lg cfu·g-1)，異型發(fā)酵LAB添加量為4.7×105cfu·g-1(5.67 lg cfu·g-1)，纖維素分解菌比例為2∶1∶1，添加量為0.3%。

3 討論

以往研究很少對多種類菌種的復合發(fā)酵進行研究，類似研究多在發(fā)酵堆肥中使用[19-20]。本研究對LAB和纖維素分解菌復合發(fā)酵的發(fā)酵比例劑量進行了優(yōu)化，而在實際發(fā)酵過程中，由于真菌和細菌的生長環(huán)境不同(好氧/厭氧)[21]，而在復合培養(yǎng)情況下僅能確定一種生長環(huán)境，因此本研究模擬青貯發(fā)酵初期的好養(yǎng)環(huán)境對復合菌種進行了優(yōu)化，得到的結果能很好地為今后青貯復合發(fā)酵添加劑的開發(fā)提供理論方法。此外，由于多種菌劑的復合發(fā)酵體系比較復雜，本研究僅對其進行了初步的探索，因此還需要繼續(xù)開展實踐研究。

本研究對復合菌種發(fā)酵體系內的LAB數量進行優(yōu)化，而未對傳統(tǒng)概念上認識的pH、乳酸或乙酸含量等發(fā)酵產物進行優(yōu)化。其一方面原因為，LAB的代謝產物較多，產生情況較為復雜，且受發(fā)酵環(huán)境和底物的影響極大，而無論其代謝產物種類如何，其必然受自身數量的影響[22]。另一方面，由于本研究中探究復合發(fā)酵體系，單純以某種LAB的代謝產物進行優(yōu)化，并和真菌數量進行響應面分析，不能反映整體情況，且指標上不具有統(tǒng)一性。另外，選取多個LAB的多種代謝產物進行優(yōu)化，其操作性較差，不易進行響應曲面優(yōu)化。復合體系中將真菌數量作為另一個優(yōu)化指標，其主要原因為本研究選取的能產生胞外酶的微生物，其產酶含量與數量呈顯著正相關關系，以數量為響應值即能很好的反映產酶的含量[5-6]。

眾所周知，LAB有抑制真菌生長的特性，而本研究需要真菌在青貯玉米發(fā)酵初期發(fā)揮其產胞外酶的特性，因此對好氧情況下真菌和LAB均達到最大值的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。研究發(fā)現，在確定的4個發(fā)酵條件中，同、異型發(fā)酵LAB的數量以及其交互作用對總體LAB數量影響最大(表3)，且當兩類LAB數量最多時，總體LAB數量也最多，這與LAB生物學基礎理論相同[23]。在發(fā)酵體系內加入的纖維素分解菌菌群的比例和劑量兩個因素對LAB數量無顯著影響(P>0.05)，也進而證明了LAB數量并未受纖維素分解菌的抑制，這與諸多的研究結果相似，他們也都認為在厭氧條件下真菌不會抑制LAB的生長[24-25]。另外，本研究為多種類菌種的復合發(fā)酵，因此選用的培養(yǎng)條件不可能達到所有菌種最適的生長環(huán)境，且實際生產中青貯玉米的發(fā)酵環(huán)境也難于控制，所以本研究僅模擬了青貯發(fā)酵初期(3 d內)的環(huán)境進行研究[26]，這可能也是導致LAB生長不受真菌抑制的主要原因。本研究還發(fā)現，在確定的4個發(fā)酵條件中，影響真菌數量的主要因素為纖維素分解菌的添加劑量，且同、異型發(fā)酵LAB添加量的交互作用對真菌也有顯著影響(P<0.05)，而纖維素分解菌的添加比例對其無顯著影響(表3)(P>0.05)，由此也進一步證實了LAB對真菌的抑制作用。另外，纖維素分解菌的比例和添加量的交互作用中以添加量為主導，其添加量越高，真菌數量越高(圖2)。這也說明了真菌添加劑量對其數量起到了決定性作用[27]。值得注意的是，當纖維素分解菌的添加比例分別與同/異型發(fā)酵LAB添加量交互時，其產生了較大變異(圖2)，這可能是不同種LAB抑制真菌的種類不同所致[28]，其具體原因還有待進一步分析研究。除此之外，當纖維素分解菌的添加劑量分別與同/異質型LAB添加量交互時，抑制真菌的效果異性發(fā)酵優(yōu)于同型發(fā)酵(圖2)，這表明異型發(fā)酵LAB產抑制真菌生長的乙酸含量高于同型發(fā)酵LAB[29-30]。

4 結論

1)LAB數量(Y1)和真菌數量(Y2)對編碼自變量A(同型發(fā)酵LAB添加量)、B(異型發(fā)酵LAB添加量)、C(纖維素分解菌比例)和D(纖維素分解菌添加劑量%)的二次多項回歸方程為：

Y1=8.56+0.50A+0.50B+0.07C+0.04D+0.09A2+0.11B2-0.01C2-2.58×10-3D2+0.21AB+0.06AC-0.04AD-0.04BC-0.06BD+0.08CD；

Y2=4.38-0.02A-0.05B-8.33×10-3C+0.32D-3.58×10-3A2-0.04B2-0.03C2+0.35D2-0.17AB+0.30AC-0.01AD-0.18BC+0.18BD-0.04CD。

2)響應曲面分析法優(yōu)化試驗條件結果為，同型發(fā)酵LAB添加量為5×105cfu·g-1，異型發(fā)酵LAB添加量為4.7×105cfu·g-1，纖維素分解菌比例黑曲霉∶綠色木霉菌∶枯草芽孢菌為2∶1∶1，添加量為0.3%。

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