細胞焦亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及其在腎臟疾病發(fā)病中作用的研究進展

劉建銘，曹靈

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

既往研究認(rèn)為，細胞死亡的方式包括壞死、凋亡和自噬等。而細胞焦亡(pyroptosis)是一種新發(fā)現(xiàn)的、不同于凋亡的程序性細胞死亡方式，其主要特征為依賴于炎性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)、細胞腫脹破裂、炎性因子外釋引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)等，是對刺激因素一種過度的應(yīng)答反應(yīng)，其最終結(jié)果是造成了細胞的損傷。細胞焦亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可分為經(jīng)典的Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑和非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。目前研究表明，細胞焦亡參與了多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，包括缺血再灌注腎損傷、糖尿病腎病、腎纖維化、晶體相關(guān)性腎病等。本文就細胞焦亡信號傳導(dǎo)機制及細胞焦亡與腎臟疾病的研究進展進行概述。

1 細胞焦亡的定義及與細胞凋亡的區(qū)別

1.1 細胞焦亡的定義 細胞焦亡是一種促炎性程序性死亡方式。1992年Zychlinsky等[1]研究發(fā)現(xiàn)，福氏志賀菌可使感染的巨噬細胞發(fā)生程序性死亡，因其與凋亡有些共同的特征，如核固縮、Caspase依賴等，當(dāng)時被認(rèn)為是凋亡，但不同的是凋亡是Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9依賴的，而這種細胞死亡方式后來被證實是Caspase-1依賴的。1998年Hubert等[2]用福氏志賀菌感染Caspase-1基因敲除巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)不會誘發(fā)細胞死亡。因此認(rèn)為Caspase-1在這種細胞死亡方式中起著重要的作用。2001年Cookson等[3]首次以“細胞焦亡”來命名這種依賴于Caspase-1的程序性細胞死亡方式。

細胞焦亡可由多種內(nèi)源及外源危險因素所觸發(fā)，包括Caspase-1依賴的經(jīng)典細胞焦亡途徑和非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑。前者途徑中，Caspase-1前體首先被募集激活，活化的Caspase-1再激活下游IL-1β和IL-18前體，同時Caspase-1的激活也會切割GasderminD膜蛋白(GSDMD)，使細胞膜破裂，炎癥因子(IL-1β、IL-18)、溶酶體等細胞內(nèi)容物釋放，從而導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)；而后者途徑中，則由Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11識別革蘭陰性菌脂多糖(LPS)，再啟動下游細胞焦亡信號通路。

1.2 細胞焦亡與細胞凋亡的區(qū)別 細胞焦亡與細胞凋亡均屬于Caspase依賴的程序性細胞死亡方式，但兩者在發(fā)生機制、細胞形態(tài)學(xué)改變等方面有明顯的區(qū)別。①Caspase可引發(fā)細胞凋亡和細胞焦亡，但參與凋亡和焦亡信號通路的Caspase不同，凋亡相關(guān)的Caspase包括應(yīng)答Caspase(Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10)和下游的效應(yīng)Caspase(Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7)，而細胞焦亡相關(guān)的Caspase則為Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11；②焦亡細胞的細胞膜可形成直徑1.1～2.4 nm的微孔，離子以及水分子等小分子進入細胞內(nèi)導(dǎo)致細胞腫脹破裂，使炎性因子和溶酶體等內(nèi)容物釋放，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，相反凋亡細胞的細胞膜保持完整，其整個凋亡過程是非炎性的；③焦亡細胞也可出現(xiàn)染色質(zhì)固縮，但其細胞核仍保持完整，焦亡細胞也可發(fā)生DNA損傷和TUNEL染色陽性，但與凋亡細胞相比其密度更低，其機制與細胞凋亡不同，凋亡細胞DNA損傷依賴于Caspase激活的DNA酶(CAD)，然而焦亡細胞的CAD仍結(jié)合于CAD的抑制因子ICAD，且DNA損傷并不是細胞破裂、降解的關(guān)鍵事件，因為阻斷DNA損傷仍然可以發(fā)生細胞焦亡[4]。

2 細胞焦亡的信號傳導(dǎo)機制

細胞焦亡途徑分為經(jīng)典的Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑和非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑，非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑由人源的Caspase-4、Caspase-5和鼠源的Caspase-11所介導(dǎo)，兩種途徑細胞的形態(tài)學(xué)改變相似。Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑主要包括炎性小體的組裝、Caspase-1前體的激活、炎性因子(IL-1β、IL-18)的活化和效應(yīng)分子GSDMD的裂解三個主要步驟，最終導(dǎo)致了細胞腫脹破裂、炎性因子釋放等生物學(xué)效應(yīng)。

2.1 經(jīng)典細胞焦亡路徑

2.1.1 炎性體的組裝是細胞焦亡的起始 炎性體是細胞內(nèi)大分子蛋白復(fù)合體，其在細胞內(nèi)的主要作用是抵抗細菌、病毒等感染因素對細胞的損傷。炎性體主要由模式識別受體(PRRs)、Caspase-1前體、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)組成。PRRs可識別細菌、病毒等外源性微生物攜帶的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和細胞內(nèi)源性損傷所釋放的危險相關(guān)分子模式(DAMPs)，PRRs主要分為兩大類：第一大類包括跨膜的Toll樣受體(TLRs)和C型凝集素受體(CLRs)；第二大類包括定位于細胞內(nèi)的RIG-I樣受體(RLR)、黑素瘤缺乏因子2受體(ALR)、NOD樣受體(NLRs)和γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)蛋白，其中ALR與IFI16同屬于PYHIN家族蛋白成員，也被稱作HIN200蛋白家族[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，人類NLRs家族有22個成員，鼠源的NLRs家族有34個成員，2002年首次發(fā)現(xiàn)NLRP1可組裝為炎性體復(fù)合物，其后逐漸發(fā)現(xiàn)了NLR家族成員NLRP3、NLRC4和PYHIN蛋白家族成員AIM2以及TRIM家族成員Pyrin也可以組裝為炎性體復(fù)合物，同時越來越多的證據(jù)表明人源的NLRP2、NLRP7、IFI16和鼠源的NLRP6、NLRP12、IFI16也可以募集并激活Caspase-1前體，活化后的Caspase-1再激活下游相關(guān)細胞焦亡因子，因此炎性體復(fù)合物的組裝是焦亡起始關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。

2.1.2 下游Caspase-1前體的活化 NLRs蛋白家族成員主要包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRC4、NLRP12等，其分子結(jié)構(gòu)都包括位于中間的中央核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NACTH)、羧基末端亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)、N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)或Caspase募集激活結(jié)構(gòu)域(CARD)，人源的NLRP1包括N端的PYD結(jié)構(gòu)域和C端的CARD結(jié)構(gòu)域，而NRC4包括CARD結(jié)構(gòu)域而無PYD結(jié)構(gòu)域。黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)和IFI16分子結(jié)構(gòu)包括N端的PYD結(jié)構(gòu)域和C端的結(jié)合配體的造血干擾素誘導(dǎo)核蛋白結(jié)構(gòu)域(HIN200)[11]。Pyrin蛋白同樣包括PYD結(jié)構(gòu)域。ASC是Caspase-1的銜接蛋白，其結(jié)構(gòu)包括N端的PYD結(jié)構(gòu)域和C端的CARD結(jié)構(gòu)域。

NLRs C端亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)參與自身抑制，其主要功能是識別配體傳遞信號，中間的NACTH結(jié)構(gòu)域參與炎性體組裝過程中的同源或異源寡聚化的調(diào)節(jié)。NLRs被相關(guān)危險因子識別后可通過其N端的PYD結(jié)構(gòu)域，與含有PYD結(jié)構(gòu)域的ASC結(jié)合，從而間接募集激活Caspase-1前體，而NLRP1、NLRC4可直接利用其自身的CARD結(jié)構(gòu)域募集并激活Caspase-1前體[7]。AIM2的HIN200結(jié)構(gòu)域結(jié)合胞質(zhì)dsDNA，而IFI16既能感受胞質(zhì)dsDNA也能感受胞核dsDNA，被dsDNA識別活化的AIM2和IFI16可通過其PYD結(jié)構(gòu)域與ASC的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，再通過ASC的CARD結(jié)構(gòu)域募集激活下游的Caspase-1前體[8]。磷酸化的Pyrin與14-3-3蛋白結(jié)合而處于失活狀態(tài)，14-3-3蛋白以同源/異源二聚體形式存在，其主要功能是結(jié)合磷酸化蛋白的絲氨酸和蘇氨酸，從而影響靶蛋白的結(jié)構(gòu)、功能。當(dāng)受到細菌毒素刺激時可使RhoA失活，Pyrin去磷酸化，去磷酸化的Pyrin與14-3-3蛋白分離，從而使CARD結(jié)構(gòu)域得以激活Caspase-1，誘導(dǎo)細胞焦亡[9]。

2.1.3 GSDMD是細胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子 炎性體可通過剪切活化Caspase-1前體，從而激活下游的IL-1β、IL-18，但Caspase-1及IL-1β等如何導(dǎo)致焦亡目前仍不完全清楚。2015年Shi等[10]用CRISPR/Caspase-9基因組編輯技術(shù)，對Caspase-1和Caspase-11介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞焦亡通路進行了全基因組范圍遺傳篩選，發(fā)現(xiàn)GSDMD蛋白可能為炎性Caspase的效應(yīng)分子。Gsdermn蛋白家族成員包括GSDMD、GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME(DFN5)和DFNB59。人類GSDMD蛋白的N端由242個氨基酸組成，C端由199個氨基酸組成，其N端與C端通過一個含有43個氨基酸的結(jié)構(gòu)連接起來。未受焦亡信號刺激的細胞其完整的GSDMD分子的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域可相互作用，表現(xiàn)出自身抑制現(xiàn)象，當(dāng)炎性Caspase切割GSDMD蛋白的N端和C端的連接結(jié)構(gòu)時，就會解除GSDMD的自身抑制作用，其N端結(jié)構(gòu)域即可遷移至細胞膜位置，與細胞膜膜磷脂、磷酸肌醇和雙磷脂酰甘油結(jié)合，且大約16個N端結(jié)構(gòu)域單體寡聚化從而使細胞膜形成直徑為10～14 nm的微孔，鈉離子及水分子內(nèi)流，鉀離子外流，細胞腫脹、破裂，胞質(zhì)內(nèi)容物及炎性因子釋放，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)[11]。Shi等[10]也發(fā)現(xiàn)GSDMD缺陷的巨噬細胞不會影響IL-1β/18的成熟，但會影響其釋放，說明GSDMD蛋白導(dǎo)致的細胞孔洞形成，是IL-1β/18外釋的必要條件。

2.2 非經(jīng)典細胞焦亡路徑 研究發(fā)現(xiàn)，生物界不僅存在經(jīng)典的細胞焦亡路徑，也存在非經(jīng)典的細胞焦亡路徑，其由人源的Caspase-4、Caspase-5及鼠源的Caspase-11所介導(dǎo)。Baker等[12]發(fā)現(xiàn)Caspase-4、Caspase-5在LPS誘導(dǎo)的人巨噬細胞焦亡中起著重要的作用。與經(jīng)典途徑不同的是，細菌脂多糖并不是通過模式識別受體與ASC、Caspase前體組裝成復(fù)合物活化Caspase前體，而是直接結(jié)合Caspase4、Caspase-5、Caspase-11的CARD結(jié)構(gòu)域，進而活化Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。另一處不同的是，Caspase-4、Caspase-5不能直接切割并激活I(lǐng)L-1β、IL-18前體，而依賴于NRLP3、Caspase-1、ASC、K+外流。2015年Schmidbrgk等[13]在Caspase-4介導(dǎo)的人單核細胞焦亡中發(fā)現(xiàn)，NLRP3的激活依賴于細胞內(nèi)K+的外流。同年Yang等[14]發(fā)現(xiàn)，細菌LPS誘導(dǎo)的Caspase-11活化可切割縫隙連接蛋白1通道(pannexin-1)，從而導(dǎo)致ATP釋放，進而開放膜通道P2X7。在ATP長時、反復(fù)刺激下，P2X7可以開放離子通道以促進K+的外流及Na+、Ca2+內(nèi)流，破壞了細胞膜完整性。同時Pannexin-1通道裂解可以激活K+通道使K+外流，K+的外流再激活NLRP3，NLRP3激活后通過ASC募集激活Caspase-1，活化的Caspase-1再剪切激活I(lǐng)L-1β/18前體，誘導(dǎo)細胞焦亡[15]。2015年Shi等[10]發(fā)現(xiàn)，GSDMD同樣參與細菌LPS誘導(dǎo)的非經(jīng)典細胞焦亡，同時發(fā)現(xiàn)Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11可直接切割GSDMD蛋白，其N端結(jié)構(gòu)域可損傷細胞膜，機制類似于經(jīng)典途徑細胞焦亡。

因此細菌LPS直接結(jié)合Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11的CARD結(jié)構(gòu)域并激活Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11，活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11一方面通過切割Pannexin-1導(dǎo)致ATP釋放，激活P2X7膜通道，破壞細胞膜完整性，使細胞內(nèi)K+外流，激活NLRP3參與到IL-1β的釋放及Caspase-1的活化。另一方面活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11可直接切割GSDMD，暴露其N端結(jié)構(gòu)功能域，使細胞膜形成微孔，膜通透性發(fā)生改變，細胞腫脹、破裂，誘導(dǎo)細胞焦亡。

3 細胞焦亡與腎臟疾病的關(guān)系

3.1 細胞焦亡與缺血再灌注腎損傷 急性腎損傷是一種由多種原因?qū)е碌募毙阅I小管上皮細胞死亡，而腎臟缺血再灌注是導(dǎo)致急性腎損傷的一個主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)，除凋亡和壞死等傳統(tǒng)的細胞死亡方式外，細胞焦亡在缺血再灌注腎損傷中也起著重要的作用。2013年Yang等[16]在小鼠腎臟缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，Caspase-1、Caspase-11、IL-1β等焦亡相關(guān)蛋白表達增加。在NRK-52E細胞缺氧復(fù)氧模型中發(fā)現(xiàn)了細胞孔洞的形成及乳酸脫氫酶的釋放，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注/缺氧復(fù)氧發(fā)生前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物C/EBP同源蛋白(CHOP)表達量增加，以siRNA沉默CHOP基因可顯著減少NRK-52E細胞的焦亡，Caspase-11、IL-1β的生成也減少，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了缺血再灌注腎小管上皮細胞的焦亡。2016年陳雨等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注/缺氧復(fù)氧上調(diào)了腎小管上皮細胞動力相關(guān)蛋白1(Drpl)，Drp1過表達使線粒體結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變，從而產(chǎn)生大量活性氧，線粒體來源的活性氧可激活NLRP3及下游焦亡相關(guān)因子，導(dǎo)致細胞焦亡，而抑制Drp1的表達可使焦亡細胞明顯減少，因此線粒體功能障礙在缺血再灌注損傷細胞焦亡中起著重要的作用。

3.2 細胞焦亡與糖尿病腎病 糖尿病腎病是一種常見的腎臟疾病，是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。細胞焦亡是一種促炎性的細胞死亡方式，其在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。高血糖狀態(tài)下機體可生成多種危險相關(guān)分子如脂肪酸、活性氧等，可被相關(guān)的PRRs所識別，從而啟動細胞焦亡[18]。Xue等[19]研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA MALAT1參與了糖尿病腎病腎小管上皮細胞的焦亡過程。MALAT1抑制了mir-23c的表達，mir-23c的下調(diào)促進了其靶基因ELAVL1的表達，ELAVL1是一種細胞焦亡相關(guān)蛋白，ELAVL1表達增加后可促進下游NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1的生成，最終導(dǎo)致腎臟炎癥反應(yīng)和細胞焦亡。李嶸等[20]研究發(fā)現(xiàn)，mi-497可通過直接靶向抑制NLRP1的表達，從而減少IL-1β、Caspase-1等焦亡相關(guān)因子的表達，抑制高糖和胰島素誘導(dǎo)的系膜細胞焦亡。由此可見，長鏈非編碼RNA及microRNA可調(diào)控高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞的焦亡，而調(diào)控細胞焦亡的其他分子機制仍有待進一步研究。

3.3 細胞焦亡與腎纖維化 腎臟纖維化是多種腎臟疾病進展至ERSD的最終途徑。已有研究表明，TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、JAK/STAT等多種信號通路參與了腎臟纖維化的進展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡同樣參與了腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，Guo等[21]研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因敲除的UUO小鼠與野生型相比，其活化的Casapse-1/IL-18/IL-1β明顯減少，且腎小球的損傷及小管間質(zhì)纖維化明顯減輕。梁文杰[22]研究發(fā)現(xiàn)，化淤解毒中藥可通過抑制UUO大鼠NF-κB的激活使NLRP3、IL-18/IL-1β前體生成減少，因而抑制了NLRP3/Caspase-1/IL-18/IL-1β軸的激活。由此可見，細胞焦亡在腎臟纖維化的進展中起著重要的作用，對焦亡通路及調(diào)控機制的進一步研究有助于延緩腎臟纖維化進展。

3.4 細胞焦亡與晶體相關(guān)性腎病 晶體相關(guān)性腎病是指由草酸鈣、尿酸結(jié)晶等大量沉積于腎小管導(dǎo)致的急性腎損傷、慢性腎臟疾病、腎結(jié)石等腎臟疾病。目前研究認(rèn)為，結(jié)晶狀物質(zhì)沉積于腎小管導(dǎo)致腎功能損害主要原因之一是，大量結(jié)晶堵塞腎小管導(dǎo)致腎小囊內(nèi)壓增加，腎臟積水等使腎小球濾過率下降，腎臟功能損傷；另外沉積于腎小管的晶體可以激活NLRP3炎性體及下游焦亡相關(guān)信號分子，致腎小管上皮細胞焦亡[18]。Mulay等[23]發(fā)現(xiàn)，在高草酸鈣飲食誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠中，樹突狀細胞可通過NLRP3/ASC/Caspase-1軸釋放IL-1β，而敲除NLRP3/ASC/Caspase-1的基因后，其腎小管損傷和炎癥反應(yīng)有所減輕。Xiao等[24]以含100 μg/mL尿酸培養(yǎng)液培養(yǎng)腎小管上皮細胞發(fā)現(xiàn)TLR4、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達的增加，予以TLR4的阻滯劑TAK242干預(yù)后NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達明顯減少，說明尿酸可通過TLR4激活NLRP3及下游焦亡信號因子，導(dǎo)致腎臟炎癥反應(yīng)及細胞焦亡。以上研究表明，干預(yù)細胞焦亡通路可減輕晶體相關(guān)性腎損傷。

4 結(jié)語

細胞焦亡是新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡方式，內(nèi)源性和外源性刺激因子可通過經(jīng)典焦亡路徑與非經(jīng)典路徑激活焦亡信號通路參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，NLRP3、Caspase-1、IL-18/IL-1β是腎臟細胞焦亡路徑的關(guān)鍵因子。但目前對于細胞焦亡參與腎臟疾病的相關(guān)分子機制及調(diào)控機制研究尚較少，對細胞焦亡參與腎臟疾病進行更加深入的研究，有助于進一步揭示其參與腎臟疾病的分子機制，為研發(fā)特異性阻斷腎臟疾病進展的藥物提供理論依據(jù)。