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    超聲聯(lián)合無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在早孕期胎兒染色體異常篩查中的價值

    2018-08-23 08:36:56尹虹李揚羅穎汝艷輝鄒玉芬潘銘智
    山東醫(yī)藥 2018年30期
    關鍵詞:整倍體核型三體

    尹虹,李揚,羅穎,汝艷輝,鄒玉芬,潘銘智

    (山東省婦幼保健院 國家衛(wèi)生計生委生育調(diào)控技術重點實驗室 山東省優(yōu)生技術重點實驗室,濟南250014)

    胎兒染色體異常是嚴重的先天性疾病,開展產(chǎn)前診斷工作是降低新生兒染色體異常發(fā)生的重要措施。羊水細胞染色體核型檢測是目前進行胎兒染色體核型分析的金標準,是產(chǎn)前診斷最常用的侵入性操作[1]。但羊水穿刺屬于有創(chuàng)性操作,可導致0.2%~2.0%的孕婦發(fā)生流產(chǎn)、胎兒丟失[2]。產(chǎn)前超聲檢查是最常用的產(chǎn)前無創(chuàng)檢查方法,而無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)是分析胎兒是否有染色體非整倍體異常的一項無創(chuàng)檢測技術,已在全球范圍內(nèi)得到了廣泛應用。本研究就早孕期超聲聯(lián)合NIPT篩查胎兒染色體異常的準確性進行研究,探討非侵入性聯(lián)合篩查方法在早孕期診斷胎兒染色體異常的價值。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 從2017年4月~2018年4月就診于我院進行早孕期篩查的3 617例孕婦中,篩選出需行羊水細胞染色體核型檢測的高危孕婦312例,年齡22~43歲,孕11~13+6周,單胎妊娠298例、多胎妊娠14例。納入標準:早孕期超聲結構異常孕婦;NIPT篩查高風險孕婦;高體質(zhì)量孕婦、高齡孕婦、體外受精-胚胎移植方式受孕孕婦、雙胎孕婦及合并惡性腫瘤孕婦。排除標準:因中止妊娠而未行羊水細胞染色體核型檢測的孕婦;拒絕行羊水細胞染色體核型檢測的孕婦;錯過最佳羊水細胞染色體核型檢測時機的孕婦。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核同意,孕婦及家屬對診斷方法完全知曉,并自愿簽署知情同意書。

    1.2 超聲檢查

    1.2.1 超聲檢查方法 采用GE Voluson E10彩色多普勒超聲診斷儀,二維探頭,頻率1.6~4.5 MHz。孕婦檢查前排空膀胱,取仰臥位。對每一胎兒進行系統(tǒng)篩查,嚴格按照英國胎兒醫(yī)學基金會標準進行圖像采集及分析,由兩名獲得產(chǎn)前篩查資質(zhì)的醫(yī)生對圖像進行質(zhì)量控制。如因孕婦腹壁較厚等原因造成經(jīng)腹部圖像質(zhì)量欠佳,則行經(jīng)陰道超聲檢查,陰道探頭,頻率5~9 MHz。采集平面包括:①矢狀切面,顯示胎兒鼻骨、顱內(nèi)正中矢狀面、胸腹壁、脊柱的連續(xù)性及背部皮膚的完整性;②顱腦橫切面,顯示顱骨環(huán)狀強回聲、腦中線及雙側(cè)脈絡叢;③胸部橫切面,顯示心臟位置、心尖指向、四腔心結構及注意是否有三尖瓣反流;④腹部橫切面,顯示胃泡、膀胱、臍帶腹壁入口、臍動脈及靜脈導管頻譜;⑤胎兒雙側(cè)上下肢切面,觀察雙側(cè)上下肢的完整性及活動狀態(tài)。

    1.2.2 超聲判斷胎兒染色體異常標準 包括胎兒超聲結構異常、超聲軟指標異常及其他與染色體異常相關的超聲指標。結構異常包括心臟畸形(明顯的心臟位置異常、單心室、完全性心內(nèi)膜墊缺損、典型的左心或右心發(fā)育不良)、十二指腸閉鎖、顱內(nèi)結構異常(全前腦)、腹壁缺損(臍疝)、馬蹄內(nèi)翻足等外表肢體發(fā)育異常[3]。胎兒超聲軟指標異常包括:腦室擴張、心室強光點、腸管強回聲、單臍動脈及腎盂擴張、股骨或肱骨短小、胎兒頸部透明帶的厚度(NT)增厚、鼻骨缺失、脈絡叢囊腫[4]。其他超聲指標包括額上頜角增大、三尖瓣反流和靜脈導管a波倒置。

    1.3 NIPT檢測 于早孕期采集孕婦外周血10 mL,置于EDTA抗凝管中,樣本收集后4 ℃條件下進行血漿分離,提取血漿中游離DNA,PCR擴增,獲得對應樣本的DNA文庫,高通量檢測,將測序結果進行生物信息學分析。通過計算測試樣本待測染色體的比例與總體人群的比例之差,除以對照組中待測染色體的方差,所得值為Z值,其切值為±3。

    1.4 羊水細胞染色體核型檢測 在超聲儀定位下,無菌操作行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL,離心10 min,留取0.5 mL,制成細胞懸液,加入培養(yǎng)基混勻,置5%CO2、37 ℃溫箱行開放式培養(yǎng)。經(jīng)適當天數(shù)更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),觀察羊水細胞生長良好。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入一定量的秋水仙素,使細胞分裂停止在中期,再經(jīng)37 ℃低滲、固定、制片、顯帶、染色處理,即得到用于染色體核型分析的羊水細胞表本片,再進行計數(shù)、核型分析。

    1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。以羊水細胞染色體核型檢測結果為金標準,使用χ2檢驗分析超聲、NIPT、超聲聯(lián)合NIPT三種篩查方案的準確性。使用受試者工作特征(ROC)曲線,計算ROC曲線下面積(AUC),分析超聲、NIPT及超聲聯(lián)合NIPT三種篩查方法的診斷效能。

    2 結果

    2.1 超聲篩查結果 共判定胎兒可能存在染色體異常78例。其中結構異常26例,包括心臟結構異常11例、巨膀胱1例、腹壁裂2例、臍膨出4例、全前腦3例、心臟結構異常合并NT增厚2例、臍膨出合并NT增厚1例、先天性骨發(fā)育不良合并心臟結構異常1例、單臍動脈合并腹壁裂及心臟結構異常1例;胎兒超聲軟指標異常44例,包括單臍動脈8例、鼻骨缺失6例、NT增厚21例、側(cè)腦室脈絡叢囊腫3例、股骨或肱骨短小3例、單臍動脈合并鼻骨缺失1例、NT增厚合并鼻骨缺失2例;其他超聲指標異常8例,包括額上頜角增大3例、三尖瓣反流3例和靜脈導管a波倒置2例。

    2.2 NIPT篩查結果 篩查出高風險共計31例,其中21-三體綜合征(簡稱21-三體18)高風險15例、18-三體綜合征(簡稱18-三體)高風險12例、13-三體綜合征(簡稱13-三體)高風險4例。

    2.3 染色體核型分析結果 共檢測出染色體異常27例,其中21-三體15例、18-三體9例、13-三體2例、Turner綜合征1例。31例NIPT高風險人群中,經(jīng)染色體核型分析確診為染色體異常者共26例,包括21-三體15例、18-三體9例、13-三體2例。

    2.4 三種篩查方法的準確性比較 超聲、NIPT、超聲聯(lián)合NIPT三種篩查方法的準確性分別為34.6%(27/78)、87.1%(26/31)、93.1%(27/29)。超聲準確性低于其他兩種方法(P均<0.01),NIPT與超聲聯(lián)合NIPT檢測的準確性差異無統(tǒng)計學意義。

    2.5 超聲、NIPT及超聲聯(lián)合NIPT篩查方法的診斷效能比較 超聲聯(lián)合NIPT具有最高的AUC。見表1。

    表1 三種方法診斷胎兒染色體異常的AUC

    3 討論

    盡早發(fā)現(xiàn)并診斷胎兒的嚴重結構異常及染色體異常,不僅能夠減輕孕婦家庭及社會的經(jīng)濟負擔,而且也能夠在孕婦與胎兒尚未建立親密情感之前,最大程度減輕孕婦的身心傷害。對臨床醫(yī)師來說,能夠爭取一定時間,建立最佳臨床決策。目前,大多數(shù)地區(qū)進行產(chǎn)前篩查主要在妊娠中期采用血清學方法篩查胎兒染色體異常,及孕20~24周時采用超聲篩查胎兒結構異常,如果篩查發(fā)現(xiàn)異常,則通過羊水穿刺或超聲進行診斷,以降低缺陷兒的出生率。但是因中孕期篩查和診斷異常胎兒一旦確診,終止妊娠的孕周較大,對母親身心影響也較大。Nicolaides等[5]提出,應將產(chǎn)篩改變?yōu)榈菇鹱炙J?,不再將重點放在中晚孕,而是將篩查的核心放在早孕期,強調(diào)早孕期檢查不僅能診斷或提示大部分嚴重的結構異常,還能通過超聲軟指標發(fā)現(xiàn)大多數(shù)染色體非整倍體的胎兒。羊水穿刺、培養(yǎng)后進行傳統(tǒng)的染色體核型分析,為目前國內(nèi)外公認的診斷染色體疾病的金標準[6]。但中孕期進行羊水穿刺為一種創(chuàng)傷性診斷方法,介入性穿刺本身具有一定的風險性,其并發(fā)癥主要包括流產(chǎn)、羊水自穿刺孔滲漏、胎兒損傷、宮內(nèi)感染、母體損傷等,其中0.2%~2.0%的羊水穿刺可能導致流產(chǎn)、胎兒丟失[2]。另一方面,羊水穿刺能夠增加孕婦及家屬的焦慮和精神負擔,孕婦對羊水穿刺的接受程度不高。因此,尋求另一種無創(chuàng)傷、孕婦接受程度高的方法評價胎兒是否有染色體異常具有重要意義。

    產(chǎn)前超聲檢查對于降低出生缺陷、提高人口整體質(zhì)量具有重要作用。隨著超聲儀器分辨率及超聲診斷醫(yī)師水平的不斷提高,使得在早孕期對胎兒進行全面評估并診斷較嚴重畸形成為可能。早孕期超聲篩查主要包括兩部分內(nèi)容,篩查非整倍體染色體異常和篩查嚴重結構異常。國際婦產(chǎn)科超聲學會(ISUOG)2013年提出,超聲技術的發(fā)展尤其高頻率經(jīng)陰道探頭的使用可在早孕期詳細評價胎兒發(fā)育情況;其發(fā)布的孕11~13+6周早期胎兒超聲檢查操作指南中指出,早孕期超聲檢查可確定胎兒存活情況并測量胎兒大小以核對孕周,測量NT值協(xié)助染色體篩查,多胎妊娠時可明確胎兒數(shù)目以及絨毛膜性,并且提出早孕期還應對胎兒解剖結構進行詳細探查,包括頭、頸部、顏面、脊柱、胸部、心臟、腹部、腹壁、四肢以及胎盤、臍帶等胎兒附屬物[7]。對胎兒進行細致的早孕期篩查,不僅可檢查出絕大多數(shù)的畸形,而且能夠指導孕婦對染色體是否存在異常進行進一步篩查。早孕期胎兒超聲篩查染色體異常的指標主要有NT增厚、鼻骨缺如、三尖瓣反流、靜脈導管a波反向、額上頜角增大等。利用NT增厚篩查21-三體的靈敏度為80%,假陽性率為5%[8]。鼻骨缺如篩查21-三體的陽性似然比為146(95%CI50~434)[9]。單純利用靜脈導管a波異常篩查非整倍體染色體異常效能較低,但聯(lián)合利用NT和靜脈導管a波異常其篩查非整倍體染色體異常的靈敏度可達93.5%[10]。本研究中,超聲篩查出的嚴重結構異常主要包括心臟結構異常(心內(nèi)膜墊缺損、單心室、右室雙出口,肺動脈瓣缺如等)、無腦畸形、先天性骨發(fā)育不良、巨膀胱、腹腔囊腫、消化道畸形、臍膨出、腹壁裂、全前腦等,同時也包括單臍動脈、側(cè)腦室脈絡叢囊腫、鼻骨缺失、NT增厚等能提示染色體異常的超聲軟指標,及與染色體有關的異常指標包括三尖瓣反流、靜脈導管a波倒置和額上頜角增大等。這些均提示早孕期超聲篩查不僅對診斷嚴重結構異常具有重要臨床價值,對可疑染色體異常的胎兒也能及時發(fā)現(xiàn),并能及時建議孕婦做進一步檢查以確診。

    NIPT技術是通過抽取母體外周血檢測胎兒游離DNA含量,推算染色體異常風險率。Fan等[11]首次基于高通量測序?qū)?8例樣本進行分析,準確檢出9例21-三體、2例18三體、1例13三體和6例染色體整倍體。隨后的研究表明,無創(chuàng)基因檢測技術對染色體非整倍體檢測的特異性和敏感度分別達99%和100%,假陽性率低于5%[12,13]。本研究中,NIPT高風險31例,對21-三體的診斷準確率較高,而對于18-三體及13-三體的診斷準確率較低,可能與18-三體及13-三體的樣本較少有關。

    胎兒染色體異常是嚴重的先天性疾病,開展產(chǎn)前診斷工作是降低染色體異常的發(fā)生的重要措施。產(chǎn)前常見的遺傳疾病有21-三體、18-三體、13-三體、Turner綜合征、Klinefelter綜合征等,羊水穿刺胎兒染色體核型分析對準確判斷胎兒染色體有著重要作用。有研究表明,在高危孕婦中羊水細胞染色體異常檢出率為2.80%~5.80%[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn),早孕期超聲篩查胎兒染色體異常的診斷效能低于NIPT,而超聲篩查聯(lián)合NIPT能夠提高診斷胎兒染色體異常的診斷效能,提示超聲篩查聯(lián)合NIPT能更好、更早地篩查染色體非整倍體異常。超聲結構異常雖然能夠提示染色體異常,但有些染色體異常的胎兒在超聲篩查中表現(xiàn)為結構上未見明顯重大異常。因此,早孕期超聲篩查雖然能排查出胎兒嚴重結構問題,但對于染色體異常的篩查還需要NIPT的輔助。本研究中有1例在早孕期NIPT篩查為低風險,早孕超聲提示NT增厚,行中孕期羊水細胞染色體核型分析,檢查結果為Turner綜合征。此病例提示盡管NIPT篩查為低風險,但是如果胎兒合并與染色體異常有關的超聲表現(xiàn)時,也要建議孕婦進一步做羊水細胞染色體核型分析以確診胎兒是否有染色體異常。

    我們認為:①早孕期超聲篩查雖然能夠檢查出胎兒嚴重結構異常,但是其也有自身局限性,對于染色體異常的胎兒,其檢出率并不高,特別是21-三體的胎兒,由于缺乏特異性超聲表現(xiàn),超聲未必有可見的結構異常。②NIPT對染色體異常篩查雖然具有一定優(yōu)勢,能夠避免產(chǎn)前診斷引起的流產(chǎn)和宮內(nèi)感染,但也有其自身局限性,能夠影響孕婦外周血游離胎兒DNA的因素都能夠影響到結果。③NIPT雖然能夠篩查一部分染色體異常,但是對于早孕期超聲篩查有異常,特別是有超聲軟指標異常者,應行中孕期羊水細胞染色體核型分析。④對于高體質(zhì)量孕婦、高齡孕婦、體外受精-胚胎移植方式受孕孕婦、雙胎孕婦及合并惡性腫瘤孕婦,即使早孕超聲與NIPT篩查未見異常,也建議于中孕期行羊水細胞染色體核型分析。

    綜上所述,早孕期超聲檢查聯(lián)合NIPT檢測能夠提高染色體異常的檢出率,能夠及時篩查出嚴重危害胎兒的結構畸形及染色體異常,為臨床決策爭取一定時間,同時超聲檢查聯(lián)合NIPT檢測為非侵入性的篩查,可盡可能地減輕對孕婦及胎兒的身心傷害。

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