自身免疫性肝病抗原抗體研究及臨床意義

趙丹彤，閆惠平

自身免疫性肝?。╝utoimmune liver disease,AILD）是一組病因未明的由于自身免疫反應(yīng)造成肝膽系統(tǒng)損傷的慢性進展性肝臟疾病，主要包括自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）、原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis,PBC）和原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis,PSC）。不同類型的AILD有不同特征的自身抗體，自身抗原和抗體不僅在發(fā)病機制中發(fā)揮作用，而且還有重要的臨床價值。本文就AILD相關(guān)抗原抗體的研究進展及臨床意義作一綜述。

1 自身免疫性肝炎

AIH是一種慢性炎癥性肝病，主要影響女性，以高 γ-球蛋白血癥，血液循環(huán)中存在自身抗體為特征，與人類白細胞抗原HLA-DR3或DR4相關(guān)，肝組織學(xué)表現(xiàn)為界面性肝炎，對免疫抑制劑治療應(yīng)答有效。

1.1 抗核抗體（antinuclear antibody,ANA）、抗平滑肌抗體（anti-smooth muscle antibody,ASMA） 高滴度ANA和ASMA陽性是1型AIH的主要標志[1]，但這些抗體并非疾病特異性抗體。ANA相應(yīng)的靶抗原包括組蛋白、雙鏈DNA、核染色質(zhì)和核糖核蛋白復(fù)合物等，抗原譜有較大的異質(zhì)性，臨床常用免疫印跡或ELISA法檢測ANA靶抗原對應(yīng)的自身抗體[2]。采用間接免疫熒光法檢測時，AIH患者ANA在Hep-2細胞中的熒光模式多呈現(xiàn)為核均質(zhì)型和核顆粒型以及多種核型之混合型。盡管AIH患者50%～70%表現(xiàn)為ANA陽性（在我國報告檢出率更高），但迄今為止，未能確定AIH具有特異性的ANA靶抗原。ASMA靶抗原為包括F肌動蛋白、G肌動蛋白在內(nèi)的多種細胞骨架分子，抗肌動蛋白抗體在AIH患者中的陽性率約為41%。Healey等[3]通過一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)，ASMA陽性但ALT正常的AIH患者并不常見，但ASMA陽性且ALT升高（＞55 IU/L）的患者應(yīng)密切隨訪，因二者對AIH診斷的陽性預(yù)測值可達22%。

1.2 抗肝腎微粒體抗體-1（anti-liver-kidney microsomal antibody,抗-LKM-1）和抗肝細胞溶質(zhì)抗體-1（antiliver cytosol type 1 antibody,抗-LC-1） 抗-LKM-1和抗-LC-1是2型AIH的診斷標志。2型AIH主要累及兒童和青少年，較1型少見?？?LKM-1的主

要靶抗原為細胞色素P4502D6（CYP2D6），其可在肝細胞漿膜表達，抗-LKM-1可能通過補體激活途徑或抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用致肝細胞損傷。CYP2D6與HCV等病毒抗原序列有同源性，因此某些HCV感染者可出現(xiàn)抗-LKM-1[4]。攜帶某種特定人類白細胞抗原（HLA-DRB7*07）的患者可通過分子模擬機制對AIH易感[5]。抗-LC-1的靶抗原為亞胺甲基轉(zhuǎn)移酶-環(huán)脫氨酶（formiminotransferase cyclodeaminase,FTCD），抗-LC-1可以單獨存在，但常與抗-LKM-1同時出現(xiàn)。在10%的2型AIH患者中抗-LC-1是惟一可檢測到的自身抗體，且與AIH疾病活動度和進展有關(guān)。Yuksel等[6]用編碼CYP4502D/6和FTCD融合蛋白的DNA質(zhì)粒免疫HLA-DR3轉(zhuǎn)基因小鼠，成功構(gòu)建出擬人化AIH動物模型，該模型更接近人類AIH且有腸道菌群多樣性減少的特征，為闡明AIH發(fā)病機制及評估免疫治療有效性和安全性提供了有效的工具。

1.3 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體（anti-soluble liver antigen/liver-pancreas,抗-SLA/LP） 抗-SLA/LP在AIH患者中的陽性率為20%～30%，是目前已知惟一的AIH特異性自身抗體，診斷特異性近100%，通常預(yù)示患者病情嚴重且預(yù)后不良[7]。該抗體通常與抗-Ro52相關(guān)，具有較高的檢測一致性[8-9]?？?SLA/LP的靶抗原為SepSecS，是一種將O-磷?；?tRNA（Sep）轉(zhuǎn)化為硒半胱氨酸基-tRNA（Sec）的合酶。本團隊研究發(fā)現(xiàn)，中國AIH患者存在6條可被CD4+T細胞識別的SLA表位肽，通過TH1途徑參與AIH發(fā)病機制[10]。

1.4 抗去唾液酸糖蛋白受體抗體（anti-asialoglycoprotein receptor,抗-ASGPR） ASGPR是一種C型凝集素，主要表達在肝細胞膜上，負責(zé)清除去唾液酸糖蛋白、循環(huán)系統(tǒng)中的IgA、凋亡細胞、脂蛋白以及活化的淋巴細胞等。ASGPR是與AIH密切相關(guān)的肝特異性膜脂蛋白的組分之一?？?ASGPR主要發(fā)現(xiàn)于AIH患者，據(jù)報道在1型AIH患者中陽性率可達75%～82%；在疾病活動期、診斷初期及未進行激素治療的患者中檢出率最高，而在免疫抑制治療的過程中，該抗體水平可迅速下降[11]。由于該抗體特異性并不高，因此國內(nèi)外相關(guān)學(xué)會并未將其寫入AIH臨床實踐指南[1，12]。

1.5 其他AIH相關(guān)抗體新進展 本團隊前期采用二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析等方法，對AIH血清進行了差異蛋白鑒定，發(fā)現(xiàn)了延胡索酸水合酶（fumarate hydratase,FH）、磷酸甘油變構(gòu)酶-B（phosphoglycerate mutase isozyme B,PGAM-B）、3-磷酸甘油酸脫氫酶（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PHGDH）等值得關(guān)注的蛋白抗原[13]，并對其中兩種抗原進行了克隆表達純化，發(fā)現(xiàn)AIH患者存在抗-FH和抗-PHGDH，提示它們對AIH可能具有診斷價值[14]。隨后，對117例各類肝病患者進行了抗-PHGDH檢測，其中40例AIH患者中抗-PHGDH陽性12例，陽性率為30.7%，高于其他肝病對照組，該抗體有助于AIH診斷和鑒別診斷[15]。此外，本團隊采用商品化FH蛋白作為抗原建立間接ELISA法，對230例各類肝病患者及98例健康志愿者血清進行了抗-FH檢測，在88例AIH患者中抗-FH的陽性率為40.0%，顯著高于其他肝病對照組和健康對照組，該抗體對AIH診斷靈敏度為40%，特異度為94%，也提示其為診斷AIH的新指標[16]。

蛋白芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的高通量蛋白組學(xué)技術(shù)，為自身免疫病相關(guān)自身抗體的篩選提供了新的技術(shù)手段。Zingaretti 等[17]采用1626種人重組蛋白芯片，從AIH患者血清中篩選出識別其中6種蛋白的抗體，其中針對表達在白細胞和肝細胞表面的IL4受體（CD124）III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域靶抗原的抗體對AIH的靈敏度和特異度最高。值得關(guān)注的是，AIH患者血清可以阻止由IL4結(jié)合CD124所致的STAT6磷酸化，表明該抗體具有功能性中和IL4的效應(yīng)，從而參與AIH發(fā)病機制。

肝移植術(shù)后新發(fā)AIH是近年關(guān)注的一個熱點，但無高-γ球蛋白血癥一直是其診斷難點。Clemente等[18]在1例肝移植術(shù)后7年發(fā)生AIH的9歲男孩體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種針對CYP-2C19抗原的新型抗肝細胞微粒體抗體，而患者血清γ球蛋白水平一直正常。該發(fā)現(xiàn)為研究同種異體肝移植導(dǎo)致AIH的自身免疫應(yīng)答提供了新的視角，并提出采用人類組織而不是動物組織進行自身抗體檢測可能更有助于新發(fā)AIH的診斷。

2 原發(fā)性膽汁性膽管炎

PBC又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化，是以肝內(nèi)小膽管病變?yōu)橹鞯囊环NAILD，病因尚不明確。抗線粒體抗體（anti-mitochondiral antibodies,AMA）是其臨床診斷的重要標志物。PBC患者存在的自身抗體主要為兩類：AMA類（包括AMA-M2亞型抗體等）及ANA類。PBC患者出現(xiàn)的ANA可能包括抗-spl00、抗-gp210、抗著絲點抗體、抗干燥綜合征A抗原抗體／抗干燥綜合征B抗原抗體等[19]。

2.1 AMA AMA分為M1～M9九個亞型，其中M2是AMA的主要亞型，是診斷PBC的標志性抗體，診斷特異性高達90%～95%，對PBC診斷、預(yù)后及無癥狀者隨訪有重要意義[20-22]。其主要靶抗原為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基（E2 component of the pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2）。PDC-E2為線粒體內(nèi)膜上的2-酮酸脫氫酶復(fù)合物一個成分，另外兩種成分為酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體側(cè)鏈E2亞基，3種組分的融合表達產(chǎn)物稱為BPO。在這些酶組分中，80%～90%的M2特異性自身抗體靶抗原為PDC-E2，還有4%～13%的患者只針對其余兩種組分。與采用天然PDC包被或僅包被BPO的ELISA檢測系統(tǒng)相比，采用融合重組蛋白BPO與天然PDC純化抗原混合作為包被抗原可提高PBC的檢測敏感性[23]。

2.2 核點型ANA及核周型ANA 這兩種ANA核型是歐洲肝病學(xué)研究會的PBC指南中所稱的PBC特異性抗核抗體，我國PBC患者ANA主要核型除了核周型、核點型之外，還常見到著絲點型[24]。核點型ANA可進一步分為多核點型和少核點型，其靶抗原主要包括sp100（可溶性酸性磷酸化核蛋白）、sp140、早幼粒細胞型白血病抗原、微小泛素相關(guān)修飾因子等[25]。抗-sp100在PBC患者中的陽性率為30%，對PBC的診斷特異性＞95%，是AMA陰性PBC的輔助診斷指標。抗著絲點抗體與門靜脈高壓的發(fā)生相關(guān)。

核周型（又稱核膜型）ANA，核膜主要由雙核膜、板層素網(wǎng)和核孔復(fù)合物3種成分組成。其中核孔復(fù)合物包括相對分子量為210 kD的跨膜糖蛋白（gp210）和62 kD的p62跨膜蛋白。抗-gp210對PBC診斷具有高度特異性（＞95%），在PBC患者中的陽性率為8%～30%，是AMA陰性PBC的診斷指標，是發(fā)展為肝衰竭的危險因素[26]。

除抗-gp210、抗-sp100外，抗-p62、抗核板素B受體對AMA陰性PBC具有輔助診斷價值[21]，抗-SOX13、抗-SUMO-1、抗-SUMO-2在 PBC診斷中的價值也有報道[27]，但臨床應(yīng)用較少。

2.3 其他PBC相關(guān)抗體新進展 PBC患者血清還存在一種Hep2細胞染色呈胞漿斑點狀熒光模式的抗體，所針對的靶抗原為mRNA加工小體（P小體），又稱甘氨酸色氨酸包涵體簡稱GW小體。該抗體可見于5%～10%PBC患者，但與肝功能失代償和Mayo評分無明顯相關(guān)性[28]。

近年，國內(nèi)外研究團隊相繼采用高通量蛋白芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定了一些與PBC高度相關(guān)且敏感的特異性自身抗原[29-30]，主要包括HK1亞型1、HK1亞 型 2、KLHL12、KLHL7、ZBTB2和 EIF2C1。其中，HK1是一種位于線粒體外膜的己糖激酶；KLHL12位于細胞核內(nèi)，負責(zé)膠原蛋白輸出，與多巴胺D4受體和Dishevelled蛋白泛素化相關(guān)?？?HK1和抗-KLHL12兩種抗體聯(lián)合檢測對PBC診斷的特異性≥95%，敏感性高于抗-gp210和抗-sp100，兩種抗體可在10%～35%的AMA陰性PBC患者中檢測到，是PBC新的診斷標志物。

3 原發(fā)性硬化性膽管炎

PSC是一種以特發(fā)性肝內(nèi)外膽管炎和纖維化導(dǎo)致多灶性膽管狹窄為特征，慢性膽汁淤積病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的AILD，目前常通過磁共振造影及內(nèi)徑逆行造影進行診斷[31]。約半數(shù)以上的PSC患者血清中可檢測到ANA、非典型核周型抗中性粒細胞胞漿抗體（perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies,p-ANCA）、SMA、抗內(nèi)皮細胞抗體、抗磷脂抗體等多種抗體，但一般為低滴度且對PSC無診斷特異性[32]。

ANCA在PSC患者中的陽性率可高達80%～94%，Hov等[33]對193例挪威PSC患者的研究表明，ANCA陽性率為80%，其中p-ANCA陽性率為70%。ANCA陽性患者比陰性患者更年輕且膽管癌陽性率較低；HLA-B*08是ANCA或p-ANCA陽性患者患PSC的危險因素；有消化性潰瘍無肝病的p-ANCA陽性患者攜帶HLADRB1*03的比率較高，表明ANCA可能是區(qū)分PSC疾病亞型的標志物。

Jendrek等[34]發(fā)現(xiàn)，腸道對抗糖蛋白2抗體（抗-GP2）的天然免疫耐受缺失與PSC疾病進展相關(guān)。GP2蛋白是復(fù)雜性克羅恩病的典型抗體，屬于胰腺抗體。IgA型抗-GP2可作為膽道疾病的新標志物，特別是PSC預(yù)后不良的危險因素及重癥PSC分類的依據(jù)，指引了PSC靶向治療方向。

總之，AILD發(fā)病機制仍未明確，相關(guān)自身抗體的研究仍在繼續(xù)。不斷發(fā)現(xiàn)和認識疾病特異性的自身抗原抗體譜，為我們了解AILD的發(fā)病機制、疾病分型、早期診斷，病程監(jiān)測、評價療效、預(yù)后判斷提供了新的依據(jù)。

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