超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析柑橘及土壤中苦參堿殘留

沈沛霖，錢 圓，衛(wèi)嚴(yán)冰，王蒙岑，朱國(guó)念

(浙江大學(xué) 農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江 杭州 310058)

苦參堿是從苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)、苦參(SophoraflavescensAit)、廣豆根(SophorasubprostrataChun et T.Chen)、山豆根(SophoratongkinensisGapnep)等槐屬植物的根、莖中提取得到的水溶性總堿，是多種生物堿的總稱，具有較為廣泛的醫(yī)用和農(nóng)用活性[1]。

苦參堿純品為白色粉末，相對(duì)密度1.16，熔點(diǎn)77 ℃，分子式為C15H24N2O，其相對(duì)分子質(zhì)量為248.37?？鄥A屬于天然植物源農(nóng)藥，對(duì)人畜低毒，是廣譜殺蟲劑，兼具觸殺和胃毒作用，其殺蟲機(jī)理是使害蟲神經(jīng)中樞麻痹，從而導(dǎo)致蟲體蛋白質(zhì)凝固、氣孔堵塞，最后窒息而死。此外，在持效期內(nèi)，苦參堿還具有趨避作用，可有效減少害蟲對(duì)作物的危害。由于苦參堿作用于害蟲神經(jīng)中樞，故其后代產(chǎn)生抗藥性的可能性大大降低[2]，對(duì)各種作物上的菜青蟲、茶小綠葉蟬、紅蜘蛛、茶尺蠖、小菜蛾等害蟲有明顯的防治效果[3-5]。同時(shí)，苦參堿兼具殺菌抑菌作用，對(duì)炭疽病、赤霉病、疫霉病、灰霉病的病原菌也具有一定的抑制作用[6-8]。

近年來(lái)，苦參堿在柑橘園中大量應(yīng)用，而且在未來(lái)的應(yīng)用也會(huì)更為廣泛。目前，國(guó)內(nèi)外雖有部分學(xué)者對(duì)苦參堿的殘留分析方法進(jìn)行了報(bào)道，但多采用傳統(tǒng)的色譜法進(jìn)行分析檢測(cè)，靈敏度和準(zhǔn)確度相對(duì)較低。因此，筆者利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-ESI-MS/MS)建立了一套快速、靈敏、可靠的殘留分析方法以檢測(cè)柑橘及土壤樣品中的苦參堿殘留，為苦參堿的生態(tài)及膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試柑橘品種為南豐密橘，柑橘和土壤樣品均采自江西省南昌市江西農(nóng)大柑橘生態(tài)園，土壤類型為黃紅壤，pH值為6.0。苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%，大連美侖生物技術(shù)有限公司)。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀UPLC-ESI-MS/MS (Waters)；色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 m×100 mm，1.8 μm)；高速勻漿機(jī)、高速離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000)、N-EVAP 11氮吹儀(杭州爾力公司)。流動(dòng)相乙腈、甲酸為色譜純；硫酸鎂、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、PSA、乙酸乙酯、甲酸等試劑均為分析純。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品的提取與凈化

QuEChERS法提取。土壤、橘肉、橘皮、全果：稱取制備好的樣品20 g于250 mL離心瓶中(橘皮和全果樣品加入20 mL去離子水)，加入50 mL乙腈，勻漿2 min，225 r·min-1振蕩30 min，過(guò)濾至裝有6 g NaCl、8 g MgSO4·7H2O的具塞量筒，劇烈振蕩1 min，靜置30 min，吸取40 mL上層溶液于梨形瓶中，濃縮近干，氮?dú)獯蹈桑齼艋?/p>

PSA凈化。向上述梨形瓶中加入2 mL色譜乙腈定容，轉(zhuǎn)移至裝有100 mg PSA和200 mg無(wú)水硫酸鎂的離心管中，渦旋凈化1 min，在超高速離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心3 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，UPLC-MS/MS待測(cè)。

1.2.2 UPLC-MS/MS分析條件

樣品采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，UPLC采用梯度洗脫。具體過(guò)程為：0～1.5 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(2/98，V/V)；1.5～2.0 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(70/30，V/V)；2.0～4.0 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(80/20，V/V)。

柱溫40 ℃，流速0.30 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜采用ESI(電噴霧離子源)正源多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，毛細(xì)管電壓3.0 KV，錐孔電壓30 V，離子源溫度120 ℃，脫劑溫度350 ℃，脫溶劑氣流量650 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1?？鄥A保留時(shí)間為2.64 min，定性離子對(duì)(m/z)250.07/149.61，定量離子對(duì)(m/z)250.07/149.61和250.07/177.73；滯留時(shí)間0.2 s，碰撞能量35 eV

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將1.0 mg·mL-1的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋配得0.1、0.2、0.5、1、2 mg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用空白樣品提取液稀釋成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液在上述UPLC-MS/MS條件下進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法定量，以進(jìn)樣濃度為X軸、響應(yīng)值為Y軸得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.4 殘留計(jì)算公式

苦參堿殘留量(mg·kg-1)=[進(jìn)樣樣品檢出量(mg)×定容體積(mL)]/[進(jìn)樣量(mL)×樣品重量(kg)]

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化后的分析條件下進(jìn)行測(cè)定，苦參堿的保留時(shí)間約為0.79 min，儀器的最小檢出量為5×10-12g。在0.1～2 mg·L-1范圍內(nèi)的苦參堿的儀器響應(yīng)值均與濃度呈良好線性關(guān)系(表1)。

表1 不同樣品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 方法的準(zhǔn)確度與精密度

取全果、橘肉、橘皮和土壤樣品(各20 g)，添加系列濃度的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每濃度處理重復(fù)5次(表2)?？鄥A在4種基質(zhì)樣品中的平均回收率為77.7%～100.0%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

表2 苦參堿在全果、橘肉、橘皮和土壤中的 平均添加回收率

3 小結(jié)與討論

目前，關(guān)于苦參堿殘留分析方法的研究報(bào)道較少，且多采用傳統(tǒng)色譜方法進(jìn)行檢測(cè)分析。孫楊等[9]使用無(wú)水乙醇超聲提取黃瓜和土壤中的苦參堿，并使用氣相色譜分析方法表明，黃瓜和土壤中苦參堿的最小檢出量均為1.36×10-12g，最低檢出濃度為0.004 mg·kg-1(黃瓜)、0.008 mg·kg-1(土壤)。郝佳等[10]采用C18固相萃取-高效液相色譜分析方法，研究了苦參堿在小白菜及土壤中的殘留和消解動(dòng)態(tài)表明，苦參堿在小白菜與土壤中的定量限(LOQ)均為0.02 mg·kg-1。陳紅平等[11]建立了茶葉中苦參堿殘留檢測(cè)的2種前處理方法，比較了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)茶葉中苦參堿殘留量分析方法的適用性。楊方等[12]建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中苦參堿與魚藤酮?dú)埩舻姆椒?，其中苦參堿的檢出限為0.86 mg·kg-1。與之前報(bào)道的方法相比較，筆者所建立的方法利用QuEChERS法提取和N-丙基乙二胺(PSA)凈化，使前處理時(shí)間得到有效縮短，且凈化效果理想，同時(shí)結(jié)合UPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)，使方法的靈敏度和準(zhǔn)確度得到了一定的提高。

在質(zhì)譜條件優(yōu)化中，分別用正、負(fù)離子模式進(jìn)行母離子全掃描，對(duì)比結(jié)果，得到正離子模式的響應(yīng)較高，因此選擇正離子檢測(cè)模式。通過(guò)調(diào)節(jié)碰撞電壓發(fā)現(xiàn)苦參堿在碰撞電壓35 eV時(shí)碎片離子較少，且主要特征子離子碎片豐度達(dá)到最大，極大提高了目標(biāo)的分析靈敏度。在流動(dòng)相條件優(yōu)化中，比較了乙腈、甲醇、水在不同組合和配比下對(duì)分離度的影響，結(jié)果表明，在乙腈-水體系中峰形尖銳對(duì)稱，同時(shí)在加入甲酸后，峰形更佳。因此，確定乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。此外，對(duì)錐孔電壓等其他參數(shù)也進(jìn)行了優(yōu)化，并通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)消除基質(zhì)效應(yīng)，使檢測(cè)條件達(dá)到最佳。

筆者利用UPLC-MS/MS建立了一套柑橘中苦參堿殘留的分析方法，并通過(guò)簡(jiǎn)化前處理步驟，優(yōu)化檢測(cè)條件等方法提高了操作的簡(jiǎn)便性和檢測(cè)的靈敏度。添加回收率試驗(yàn)結(jié)果也表明，該方法符合殘留檢測(cè)的分析要求。綜上所述，所建立的分析方法能夠用于有效檢測(cè)柑橘及土壤中苦參堿的痕量殘留，為進(jìn)一步的生態(tài)和膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了重要的方法依據(jù)。

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