犁頭草黃酮含量的測定與分離

謝娟平，黨 鑫

(安康學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西 安康 725000)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器試劑

犁頭草分別采集于安康市佛坪鎮(zhèn)、安康市漢濱區(qū)、渭南市、西安市等地。

紫外分光光度計UV-6100 PC(上海美普達儀器有限公司)；分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；超聲波清洗器KH2200E型(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱101-1AB型(天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)；循環(huán)水式真空泵SHR-Ⅲ(西安泰康生物科技有限公司)。

蘆丁對照品(純度99.9%，上海友思生物技術(shù)有限公司)；薄層層析硅膠(硅膠G，青島海浪硅膠干燥劑廠)；羧甲基纖維素鈉(AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、結(jié)晶氯化鋁等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線

對照品溶液的制備。精確稱量蘆丁標準品20 mg，移至100 mL容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻即得，備用[8]。

吸收波長的確定。取上述溶液70%乙醇稀釋5倍，于UV-6100 PC紫外可見分光光光度計上在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，得最大吸收波長為273 nm。

標準曲線的制備。取蘆丁標液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別于25 mL容量瓶中，加入5 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液，加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，得一定濃度梯度的標準系列溶液。在273 nm波長處測定吸光度值[9-10]。分別以標準品的濃度及其相應(yīng)的吸光度為橫縱坐標制作標準曲線，得相應(yīng)的回歸線方程：A=0.034 5×C+0.005 5，R2=0.999 4，線性范圍為0.8～24.0 μg·mL-1。

1.2.2 樣品液制備

另外，公路養(yǎng)護單位還要加強對各項施工材料的控制力度，防止質(zhì)量不達標的施工材料混入施工現(xiàn)場中。①瀝青材料，該項材料為公路養(yǎng)護的核心材料，在采購瀝青材料時，試驗檢驗部門需要定期抽查，一旦發(fā)現(xiàn)質(zhì)量不達標的瀝青材料，禁止其進入到施工現(xiàn)場中，針對標號與產(chǎn)地各不相同的瀝青材料，需要將其進行分類存儲。②砂石與礦粉施工材料，檢修人員可以結(jié)合《公路工程試驗規(guī)程》條例，對砂石與礦粉等施工材料進行綜合檢測，對于檢測合格的施工材料，還要妥善存放，加強各項施工材料的防潮與防腐蝕等[3]。

取不同產(chǎn)地及不同生長期犁頭草，干燥，粉碎。分別精確稱量2 g，置于不同燒杯中，加入75%乙醇溶液20 mL，超聲提取30 min，稱重，75%乙醇補足重量，過濾，取濾液2 mL于10 mL容量瓶中，加75%乙醇溶液定容至刻度線。

1.3 精密度試驗

精確吸取1.2.2節(jié)下制備的安康市鎮(zhèn)坪縣犁頭草樣品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中加3 mL的0.1 mol·L-1AlCl3乙醇溶液，加70%乙醇定容，作為精密度試驗樣品溶液。取上述溶液于273 nm測定吸光度值，計算黃酮含量。

1.4 穩(wěn)定性試驗

精確吸取1.2.2節(jié)下制備的安康市鎮(zhèn)坪縣犁頭草樣品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3節(jié)下操作，制備穩(wěn)定性試驗樣品溶液。分別于0，10，20，30，40 min時在273 nm處測定吸光度值，計算黃酮含量。

1.5 樣品檢測

取1.2.2節(jié)下制備的安康市鎮(zhèn)坪縣、安康市漢濱區(qū)、渭南市、西安市、四川省廣元市犁頭草樣品溶液，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3節(jié)下操作，制備樣品溶液，分別測定吸光度。代入A=0.034 5C+0.005 5中計算黃酮含量，比較不同產(chǎn)地及不同生長期犁頭草總黃酮含量。

1.6 分離純化

取安康市鎮(zhèn)坪縣犁頭草，60 ℃干燥，粉碎，稱取1 000 g，加75%乙醇適量使粉末濕潤膨脹24 h，裝入滲漉桶中，加5倍量75%乙醇滲漉，收集滲漉液約40 L[11-13]。以上滲漉液平分為2份，1份減壓回收干燥并稱量備用，1份用來做系統(tǒng)分離。在最大吸收波長處測定吸光度值，計算犁頭草滲漉液中的總黃酮量。

用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對犁頭草滲漉液依次萃取，得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液及水溶液部分，減壓干燥，得各萃提產(chǎn)物，按1.2.2節(jié)下方法制備供試液并按1.3節(jié)下操作測定吸光度，計算各萃取部分的總黃酮含量[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度和穩(wěn)定性

由表1可知，按1.3節(jié)操作測定的黃酮含量為50.471 mg·g-1，相對標準差(RSD)為1.438%，表明方法的精密度良好。按1.4節(jié)下操作測定不同時間下樣品黃酮含量平均值為50.485 mg·g-1，RSD為0.863%，表明穩(wěn)定性良好。

表1 方法學(xué)的試驗結(jié)果

2.2 黃酮含量

由表2可知，安康市鎮(zhèn)坪縣的犁頭草中總黃酮含量高達50.98%(故以此作為分離純化的原料)，且從3—5月生長期內(nèi)，犁頭草中總黃酮含量呈增加趨勢。

表2 不同產(chǎn)地及生長期犁頭草中的黃酮含量

2.3 分離純化

2.3.1 提取

取1.6節(jié)下滲漉液20 L(相當于原藥材500 g)，按1.5節(jié)下方法在273 nm處測定吸光度值，代入回歸方程計算滲漉液黃酮濃度為0.918 1 mg·mL-1，相當于原藥材黃酮含量為36.724 mg·g-1(提取液含量為50.98 mg·g-1)，可知75%乙醇滲濾法提取犁頭草中的黃酮類物質(zhì)的保留率為72.89%。滲漉液干燥共得粗提取物112.6 g，計算粗提物黃酮含量為16.31%。

2.3.2 系統(tǒng)分離

按1.6節(jié)下操作，進行分離純化，分別測定乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分及水溶液部分黃酮含量得到各萃取物部分黃酮總量。各萃取液濃縮干燥，得萃取物總量，如表3所示。

表3 各分離純化萃提物的黃酮含量

表3表明，乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質(zhì)的含量高達73.42%，說明犁頭草中的黃酮類成分主要富集在乙酸乙酯中，可選擇乙酸乙酯部分作為進一步分離純化及開發(fā)的主要原料。

3 小結(jié)

本文以蘆丁為對照品，0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液為顯色劑，運用紫外分光光度法在273 nm處測定了犁頭草中的總黃酮含量。精密度試驗結(jié)果RSD為1.438%，說明該方法的精密性良好。顯色穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD為0.863%，根據(jù)不同時間間隔測得的吸光度可知，在該試驗條件下顯色產(chǎn)生的亮黃色絡(luò)合物比較穩(wěn)定，可用來做定量分析。用上述方法對不同時間不同地點采摘的犁頭草進行檢測發(fā)現(xiàn)，安康市鎮(zhèn)坪縣的犁頭草總黃酮含量高達50.98%，3—5月犁頭草中的黃酮類物質(zhì)隨著生長不斷積累增加。

研究采用75%乙醇為溶劑，滲漉法提取犁頭草中有效成分，粗提取物總黃酮含量高達16.31%，有效成分保留率為72.89%，產(chǎn)品純度高，是理想的犁頭草黃酮粗提取工藝。采用系統(tǒng)分離法分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對犁頭草提取物進行萃取，檢測可知正丁醇萃取物中黃酮類物質(zhì)的含量為27.56%，乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質(zhì)的含量高達73.42%。萃取分離得到的犁頭草黃酮純度高，黃酮類化合物主要集中在乙酸乙酯部分，這為進一步研究犁頭草有效成分和相關(guān)保健產(chǎn)品的開發(fā)提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

[1] 周馳. 紫花地丁的本草考證及化學(xué)成分研究[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[2] 鄭曉輝，沈澤培，黃楓. 犁頭草治療化膿性關(guān)節(jié)炎[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23(8)：1526-1528.

[3] 張爭鳴. 犁頭冰散治療創(chuàng)傷性潰瘍120例[J]. 湖南中醫(yī)雜志，1996，12(5)：71-72.

[4] 李湘洲，欒芳菲，張勝，等. 黃酮類化合物的抗腫瘤和抗血管生成作用研究進展[J]. 食品與機械，2016，32(1)：199-201，206.

[5] 陽中和，國興明. 犁頭草化學(xué)成分研究初報[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2011，30(4)：374-376.

[6] 余燕影，彭志兵，曹樹穩(wěn). 紫外分光光度法測定豐城雞血藤中總黃酮[J]. 中草藥，2005，36(11)：1650-1651.

[7] 布雅楠，楊照生，閆正，等. 含羞草中總黃酮的提取與分離純化[J]. 化學(xué)分析計量，2016，25(5)：12-15.

[8] 謝娟平. 犁頭草中化學(xué)成分及總黃酮含量的研究[J]. 安康學(xué)院學(xué)報，2009，21(2)：95-97.

[9] ZHOU T，XIAO X，LI G，et al. Study of polyethylene glycol as a green solvent in the microwave-assisted extraction of flavone and coumarin compounds from medicinal plants[J]. Journal of Chromatography A，2011，1218(23)：3608.

[10] XIE J，ZHU L，LUO H，et al. Direct extraction of specific pharmacophoric flavonoids from gingko leaves using a molecularly imprinted polymer for quercetin[J]. Journal of Chromatography A，2001，934(1/2)：1-11.

[11] 王飛，樊金拴，馮慧英，等. 青扦針葉總黃酮超聲提取及抗氧化活性[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報，2016，31(1)243-249.

[12] 謝娟平. 陜北苦蕎麥炒制前后不同部位黃酮含量的測定及分離[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，62(6)：15-17.

[13] 李筱玲，鄧寒霜. 黃酮類化合物提取分離方法研究進展[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，61(1)：77-79，92.