補腎解毒法對多發(fā)性硬化小鼠CD4+ T細胞的作用

周哲屹，劉寶珠，裴珊珊，謝 煒 ，汪鴻浩

(1．柳州市中醫(yī)院腦病科，廣西 柳州 545002；2. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 545002；3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，廣東 廣州 510515；4.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510515)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特征[1]。MS一般可累及腦室周圍的白質(zhì)、小腦、腦干和脊髓等，常反復發(fā)作，合并多神經(jīng)功能缺損，癥狀可逐漸加重。其發(fā)病機制尚不明確，目前認為與自身免疫密切相關(guān)。CD4+T細胞的分化在MS的發(fā)病機制中占有核心地位。近期研究提示，CD4+Th1/CD4+Th2細胞軸、CD4+Th17/CD4+Treg細胞軸功能失調(diào)對MS的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義[2-4]。臨床研究認為，中醫(yī)藥治療MS具有一定的優(yōu)勢，可以改善臨床癥狀，有效緩解復發(fā)[5]。臨床觀察及前期研究認為，補腎解毒法對多發(fā)性硬化具有良好效果[6]，可能與其調(diào)節(jié)免疫功能有關(guān)，但其機制尚不明確。本研究利用MS的經(jīng)典模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型，采用免疫組織化學和流式細胞儀檢測炎性指標及Th1、Th2、Th17、Treg細胞等CD4+T細胞亞群，探討補腎解毒法對中樞神經(jīng)炎癥及外周血Th1/Th2細胞軸、Th17/Treg細胞軸的影響，從而探討補腎解毒法改善MS臨床癥狀的可能機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雌性小鼠由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2011-0015,共48只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，分籠飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，室內(nèi)溫度20～25 ℃，標準飼料及飲水，標準光照和黑暗節(jié)律12 h/12 h。

1.2 藥物 補腎解毒湯(熟地黃24 g,山茱萸、山藥各12 g,澤瀉、牡丹皮、茯苓、黃連各9 g)按常規(guī)方法煎煮，委托南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院制劑室進行加工，收集濾液并用文火煎煮濃縮制成2 g/mL的水提物，對pH值、比重、衛(wèi)生學指標等進行檢測，冷藏，用前加溫、搖勻。醋酸潑尼松片(廣東華南藥業(yè)集團公司，國藥準字 H44020682)，用磁力恒溫攪拌器攪拌均勻，用去離子水配制成0.39 mg/mL溶液。

2 方法

2.1 模型復制 使用髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55)免疫C57BL/6小鼠。將等容積MOG35-55水溶液(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,上海吉爾生化公司合成)與完全弗氏免疫佐劑(F5881 10 mL,Sigma)混合，使用玻璃注射器抽打，使其混合、乳化，制備成油包水的抗原乳劑。于免疫動物當日記為第0天，在小鼠背部脊柱中線兩側(cè)分4點皮下注射，每只0.2 mL MOG35-55抗原，然后給每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.1 mL百日咳毒素溶液(含400 ng PTX， Sigma)，誘導小鼠產(chǎn)生EAE。48 h后(第2天)再次腹腔內(nèi)注射0.1 mL PTX溶液1次。

2.2 分組與給藥 模型復制后將C57BL/6小鼠隨機分為正常組，模型組，潑尼松組，中藥低、中、高劑量組，每組8只。模型復制后第7天開始灌胃給藥，每日1次。潑尼松組予潑尼松7.8 mg/(kg·d)灌胃，各中藥組每日分別以7.2、3.6、1.8 mL/kg的中藥溶液配合相應(yīng)容積(2.8、6.4、8.2 mL/kg)蒸餾水灌胃，正常組及模型組每日給予生理鹽水(1 L/kg)灌胃1次，持續(xù)灌服30 d。

2.3 小鼠大腦組織炎癥及脫髓鞘評分 在模型復制后第30天取小鼠脊髓組織，每組8只。使用10%水合氯醛麻醉，打開胸腔從心內(nèi)插管，放入多聚甲醛灌注內(nèi)固定，取小鼠大腦組織和腰髓(腰膨大部分)，后常規(guī)脫水、石蠟包埋，石蠟切片機對組織連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色和髓鞘染色，光鏡下觀察攝像。①炎癥評分標準：沒有炎癥，計0分；炎性細胞只浸潤血管和腦脊膜周圍，計1分；少量炎性細胞浸潤腦或脊髓實質(zhì)，計2分；中量炎性細胞浸潤腦或脊髓實質(zhì)，計3分；大量炎性細胞浸潤腦或脊髓實質(zhì)，計4分。②髓鞘脫失評分標準：正常腦或脊髓白質(zhì)，計0分；點狀脫髓鞘，計1分；小片狀脫髓鞘，計2分；血管周圍融合的或者單純脫髓鞘，計3分；累及半側(cè)脊髓的廣泛脫髓鞘，計4分；累及整個脊髓的廣泛脫髓鞘，計5分。

2.4 流式細胞檢測脾CD4+T細胞亞群 將小鼠處死后，右側(cè)臥位，將左側(cè)腹部皮膚剪開，分離取出暗紅色脾臟，細胞篩上將脾臟研碎，反復沖洗、離心，加入5 mL RMPI 1640培養(yǎng)液。每個流式樣管中加入100 μL脾臟細胞懸液，細胞數(shù)約為1×106，細胞表面染色，重懸，固定后先染APC-Cy7-CD3、BV510-CD4、PerCP-Cy5.5-CD8，4 ℃孕育30 min，固定破膜劑重懸細胞，再染FITC-IFN-γ-Th1、PE-IL-4-Th2、PE-IL-17A-Th17、Alexa Fluor 647-Foxp3-Treg，緩沖液重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

2.5 ELISA法檢測培養(yǎng)脾細胞上清液中細胞因子 向上述研磨的脾臟細胞中加入5 mL RMPI 1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用ELISA試劑盒(武漢華美生物有限公司)檢測上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A水平。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠脊髓和髓鞘組織形態(tài)學變化 正常組小鼠脊髓和髓鞘未見明顯病理變化；模型組小鼠脊髓和髓鞘可見大量炎性細胞浸潤，其中以中性粒細胞和淋巴細胞為主；與模型組比較，中藥高劑量組和潑尼松組小鼠脊髓和髓鞘的炎癥評分和脫髓鞘評分均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、圖2、圖3和圖4。

3.2 各組小鼠脾細胞CD4+T細胞亞群比較 與模型組比較，中藥高劑量組、潑尼松組Treg比例升高，Th1和Th17比例降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而中藥高劑量組、潑尼松組Th2比例與模型組相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

注：A.正常組；B.模型組；C.潑尼松組；D.中藥低劑量組；E.中藥中劑量組；F.中藥高劑量組

圖1各組小鼠脊髓形態(tài)學變化(HE染色，10×10倍)

3.3 各組小鼠脾細胞中細胞因子水平比較 與正常組比較，模型組小鼠脾細胞中IL-4、IL-10水平顯著降低，IFN-γ、IL-17A水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，潑尼松和中藥高劑量組小鼠脾細胞中致炎因子IFN-γ、IL-17A顯著降低，抑炎因子IL-4、IL-10顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

注：A.正常組；B.模型組；C.潑尼松組；D.中藥低劑量組；E.中藥中劑量組；F.中藥高劑量組

圖2各組小鼠脊髓的髓鞘染色(HE染色，10×10倍)

注：B.模型組；C.潑尼松組；D.中藥低劑量組；E.中藥中劑量組；F.中藥高劑量組；與模型組比較，*P<0.05

圖3各組小鼠脊髓和髓鞘炎癥評分比較(n=8)

注：B.模型組；C.潑尼松組；D.中藥低劑量組；E.中藥中劑量組；F.中藥高劑量組；與模型組比較，*P<0.05

圖4 各組小鼠脊髓和髓鞘的脫髓鞘評分比較(n=8)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 各組小鼠脾細胞中細胞因子水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與中藥低劑量組比較，◇P<0.05

4 討論

MS當屬中醫(yī)學“痿證”“痹證”等范疇。病位在腦髓，涉及脾、肝、腎等。“腦為髓?！?，腦髓失養(yǎng)，腦功能失常，神機失用，肢體失主，痿病乃生，而腎主骨生髓，腎氣充足，髓海得養(yǎng)則腦功能健全，腎氣不足則腦髓失養(yǎng)，因此MS發(fā)病與腎關(guān)系密切[7-9]。毒邪是MS發(fā)病和復發(fā)的主要病理因素，既可以是外來之熱、濕、毒邪侵襲，也可以是內(nèi)生之濕、痰、濁、瘀。MS急性發(fā)作期邪毒侵襲人體，上犯于腦，損傷腦髓而發(fā)病。補腎解毒法符合MS腎虛為本、邪毒為標的病機認識，補腎解毒法在臨床上被認為是有效的治療MS的中醫(yī)治則[8,10]。MS的急性期有多種細胞因子的激活，以自身免疫炎性反應(yīng)為主要臨床表現(xiàn)。本研究所采用的補腎解毒方藥，是在補腎的經(jīng)典方藥——六味地黃湯的基礎(chǔ)上加清熱解毒中藥黃連而成，取其補腎解毒之功效。

T淋巴細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遷移及浸潤是實驗性MS的關(guān)鍵[11]。自身反應(yīng)性CD+Th細胞是啟動EAE病理過程的主要效應(yīng)性T淋巴細胞[12]。輔助性T細胞亞群(Th)根據(jù)細胞因子分泌模式的不同，CD4+T細胞可分為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、Treg細胞等亞群。Th1細胞亞群分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、TNF-β等促炎因子，促進炎性反應(yīng)；Th2細胞分泌IL-4、IL-10、IL-6、IL-5等抑炎因子，能延緩或阻止病情，IL-4是初始CD4+T細胞向Th2細胞進行分化的關(guān)鍵因子，在EAE模型中可減輕免疫性脫髓鞘[13]。經(jīng)典的理論認為Th1/Th2細胞軸的平衡是控制和緩解MS的有效途徑[4]。Th17細胞是有廣泛生物活性的炎性細胞因子[14]，可產(chǎn)生IL-17,具有粒細胞募集、調(diào)節(jié)免疫、介導信號轉(zhuǎn)導等多種功能，可刺激成纖維細胞及內(nèi)皮細胞分泌各種細胞因子，促進補體C3產(chǎn)生，進而誘導炎性反應(yīng)，促進MS的發(fā)病[15]。研究認為，IL-17在MS患者腦脊液和外周血單核細胞中表達升高，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)血清IL-17A水平和MS的殘疾程度呈正相關(guān)[16-17]。Treg細胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+T細胞，F(xiàn)oxp3是其關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。Treg細胞可產(chǎn)生IL-10等細胞因子抑制EAE模型的自身免疫炎性反應(yīng)，限制過度和錯誤的免疫應(yīng)答，Treg的功能失活可導致MS的病情更加嚴重[18]。綜上所述，Th1/Th2細胞軸、Th17/Treg細胞的分化偏移是MS發(fā)病的核心免疫學機制。

糖皮質(zhì)激素多用于MS急性期治療，但其長期療效并不確定，可能存在嚴重不良反應(yīng)及使用禁忌證。中醫(yī)藥在治療自身免疫性疾病中已取得較好治療效果，可以作為治療的選擇之一。現(xiàn)代藥理研究證實，中藥可從不同方面調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌功能[6]。中藥可能具有類皮質(zhì)激素樣的作用，可拮抗皮質(zhì)激素反饋性腦垂體的抑制作用，且能夠改善微循環(huán)，降低血黏度，在免疫應(yīng)答階段的T細胞識別階段識別抗原早期，激素可以對細胞免疫功能和T、B細胞增生產(chǎn)生抑制作用，減輕自身免疫反應(yīng)[19-20]，常作為對照藥物用于研究中醫(yī)方劑的免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究表明，補腎解毒法可顯著減輕EAE模型的炎性反應(yīng)，減少脫髓鞘病灶。在細胞因子水平，補腎解毒法同樣可以下調(diào)Th1細胞相關(guān)因子IFN-γ和Th17細胞相關(guān)因子IL-17A的水平，從而減輕炎性反應(yīng)；另一方面促進Th2相關(guān)細胞因子IL-4和Treg細胞相關(guān)因子IL-10的表達，高劑量組作用更明顯，和潑尼松強度相當。從脾臟細胞亞群結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，高劑量補腎解毒方藥可以抑制Th1、Th17的分化，增強Treg的免疫調(diào)節(jié)作用，該作用與醋酸潑尼松的作用相當。本實驗采用組織形態(tài)學檢測法、免疫組織化學法和流式細胞儀等方法證明補腎解毒法能夠調(diào)節(jié)EAE模型Th1/Th2細胞軸、Th17/Treg細胞軸平衡，降低炎性反應(yīng)，促進髓鞘修復。因此，調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞軸、Th17/Treg細胞軸可能是補腎解毒法作用的重要途徑。

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