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    乳源酪蛋白糖巨肽對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞抗炎及血管生成因子表達(dá)水平的影響

    2018-03-20 03:30:00王秋萍曹江鳴崔文靜馬新穎趙林森閆亞麗陳慶森
    食品科學(xué) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:乳源細(xì)胞核結(jié)腸癌

    王秋萍,賈 彥,曹江鳴,趙 培,崔文靜,馬新穎,趙林森,閆亞麗,*,陳慶森,*

    (1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津 300134;2.河北一然生物科技有限公司,河北 石家莊 050899)

    乳源酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP)除了具有良好的營養(yǎng)特性之外,還有提高智力發(fā)育、促益生菌增殖以及免疫調(diào)節(jié)等活性[1-8]。結(jié)直腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個由遺傳和環(huán)境等諸多因素經(jīng)過多步驟及內(nèi)外因交互作用的結(jié)果,目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為結(jié)直腸癌的主要發(fā)病機(jī)制分為原癌基因和抑癌基因的突變、基因組的不穩(wěn)定性[9];其中基因組不穩(wěn)定性包括染色體不穩(wěn)定、微衛(wèi)星不穩(wěn)定和核苷酸對(CpG island,GPG)、甲基化表型[10]、鋸齒狀途徑[11]。部分研究學(xué)者還認(rèn)為炎癥、腫瘤與結(jié)直腸癌密切相關(guān),尤其是炎癥性腸病最可能發(fā)展成結(jié)直腸癌,有報道指出約20%的潰瘍性結(jié)腸炎患者在發(fā)病后的30 年左右可發(fā)展成結(jié)直腸癌[12]。核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor,NF)-κB廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中,在60%~80%的結(jié)腸癌細(xì)胞中都有所表達(dá),約40%的結(jié)腸癌細(xì)胞中表現(xiàn)有NF-κB的活性,處于活性狀態(tài)的NF-κB開啟了調(diào)控一系列炎癥靶基因的工作,使其在細(xì)胞周期、凋亡和代謝病理過程中發(fā)揮重要作用[5-6,10]。近年來,本實驗室系統(tǒng)地從乳源CGMP對腸道免疫調(diào)控系統(tǒng)、腸道菌群變化的影響以及和腸道炎癥反應(yīng)的相關(guān)性等方面進(jìn)行了研究。證實乳源CGMP具有抗炎活性,在一定程度上可以改善、緩解和治愈炎癥性腸病。朱晨晨等[13]用惡唑酮誘導(dǎo)建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型,研究乳源CGMP對其結(jié)腸黏膜固有層CD4、CD8、SIgA及免疫信號通路MEKK1、Smad7表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)乳源CGMP也可顯著降低結(jié)腸黏膜固有層中CD4、CD8的表達(dá),促進(jìn)SIgA的表達(dá)。同時抑制MEKK1和Smad7蛋白的表達(dá),說明乳源CGMP具有維持腸黏膜免疫調(diào)節(jié)的平衡和保護(hù)腸黏膜免疫屏障功能。李偉等[14]研究了乳源CGMP對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群、腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞亞群和派爾集合淋巴結(jié)(peyer patch,PP)淋巴細(xì)胞亞群的影響,通過實驗結(jié)果分析,長期灌胃乳源CGMP能夠介導(dǎo)腸黏膜免疫,促進(jìn)脾臟和PP結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群顯著增多,說明乳源CGMP能夠引起這些外周免疫器官產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。脾淋巴細(xì)胞的增殖是感染反應(yīng)的一個環(huán)節(jié),抑制脾淋巴細(xì)胞增殖表現(xiàn)為抑制免疫應(yīng)答,Otani等[15]發(fā)現(xiàn)在小鼠的食物中加入乳源CGMP,可抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞的增殖,進(jìn)而表明乳源CGMP具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。Monnai等[16]發(fā)現(xiàn)乳源CGMP干預(yù)后的細(xì)胞,家族細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-lra通過與IL-1的受體結(jié)合從而阻止了IL-1的作用,因此不能啟動脾臟細(xì)胞的擴(kuò)增。Requena等[17]研究指出NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號可由牛乳糖巨肽(bovine glycomacropeptide,BGMP)激活,從而使人體巨噬細(xì)胞(human acute monocytic leukemia cell line,THP)-1的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-8和IL-1b的含量增加。Requena等[18]研究還發(fā)現(xiàn),BGMP可激活NF-κB和MAPK信號通路,上調(diào)人單核細(xì)胞TNF、IL-1β和IL-8的分泌,并認(rèn)為BGMP在腸道中可能起到抗炎的作用。Requena等[19]研究也證BGMP可以降低腸道炎癥的發(fā)生,BGMP可以抑制由刀豆蛋白誘導(dǎo)的脾細(xì)胞TNF-α和干擾素(interferon,IFN)-γ的表達(dá)。Rhoades等[20]證實了乳源CGMP可以抑制3 株腸致病性大腸桿菌對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞株的黏附能力,從而緩解結(jié)直腸癌的發(fā)展。這些都充分說明乳源CGMP在結(jié)腸炎方面具有一定的抗炎作用。Yun等[21]通過研究乳源CGMP對LPS刺激的脾臟細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A的濃度升高。乳源CGMP能夠促進(jìn)正常B淋巴細(xì)胞的增殖,所以能夠增強機(jī)體的體液免疫系統(tǒng)。李榮華等[22]利用乳源CGMP刺激體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源樹突細(xì)胞(dendritic cell,DCs),發(fā)現(xiàn)乳源CGMP可刺激DCs的成熟,并強烈地刺激生物相容復(fù)合體抗原(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ,在DCs對外源抗原的提呈過程中,MHC-Ⅱ發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,說明乳源CGMP通過調(diào)節(jié)DCs中MHC-Ⅱ來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

    基于以上的研究成果,本研究主要從炎癥因子和信號通路兩方面入手,以結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為研究對象,探究乳源CGMP的抗炎性能和免疫調(diào)節(jié)作用。通過免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細(xì)胞激活NF-κB信號通路,確定乳源CGMP通過抑制炎癥因子和血管生成因子的表達(dá),從而達(dá)到減緩炎癥的程度,更為乳源CGMP作為功能性物質(zhì)應(yīng)用于結(jié)腸的健康提供一定的科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    CGMP 新西蘭Tatua公司;人類結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞江蘇齊氏生物科技有限公司。

    LPS 美國Sigma公司;胎牛血清 美國Gibco公司;NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒、Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒 北京康為世紀(jì)科技有限公司;兔抗人p65多克隆抗體 英國Abcam公司;免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy3 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;4',6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 北京索萊寶有限公司;人8 種炎癥因子酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、人8 種血管生成因子ELISA試劑盒 美國Signosis公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HERAcell 240iCO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國Molecular Devices公司;TE2000倒置拍照顯微鏡 日本Nikon公司;X-OMAT醫(yī)用X射線膠片 銳珂(廈門)醫(yī)療器材有限公司;3K15高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司;DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳槽、DYCZ-40D迷你轉(zhuǎn)印電泳槽、DYY-2C電泳儀 北京六一儀器廠;QB-9001多孔振蕩器海門市其林貝爾儀器;Gel doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及乳源CGMP溶液制備

    結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及乳源CGMP溶液制備等方法參見文獻(xiàn)[7]。

    1.3.2 免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細(xì)胞激活NF-κB信號通路

    1.3.2.1 LPS細(xì)胞實驗分組

    LPS溶液的配制:準(zhǔn)確稱取50 mg LPS于5 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基中,針頭過濾器過濾,-20 ℃凍存,使用時用DMEM培養(yǎng)基梯度稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

    HT-29細(xì)胞正常培養(yǎng),傳代進(jìn)行2~3 次,然后進(jìn)行分組:正常對照組、LPS組1(0.01 μg/mL)、LPS組2(0.1 μg/mL)、LPS組3(1 μg/mL)、LPS組4(10 μg/mL),每組3 個復(fù)孔。

    1.3.2.2 細(xì)胞爬片的制備

    在48 孔板內(nèi)滴入2 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS),然后用鑷子放入玻片以確保其固定在孔板內(nèi)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌3 次,胰酶消化后用于計數(shù);用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL,均勻接種細(xì)胞爬片,每孔100 μL,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出孔板棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌1 次,正常對照組加100 μL完全培養(yǎng)基,LPS組加入不同質(zhì)量濃度的LPS溶液100 μL,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。用彎針頭挑出細(xì)胞爬片置于培養(yǎng)皿蓋上,PBS洗滌1 次。

    1.3.2.3 免疫熒光圖的觀測

    1)固定:每個細(xì)胞爬片加入100 μL 4%多聚甲醛固定液固定10 min。2)洗滌:吸除固定液,用洗滌液洗滌3 次,每次4 min,注意每次在洗滌過程中盡量吸盡殘余液體,同時要保證表面的濕潤度,最后一次完全去除洗滌液。3)封閉:加入100 μL的免疫染色封閉液,室溫封閉1 h。4)一抗反應(yīng):吸除免疫染色封閉液,加入封閉液稀釋的NF-κB p65抗體(封閉液與抗體體積比為80∶1),在4 ℃條件下孵育過夜。5)洗滌:重復(fù)步驟2)。6)二抗反應(yīng):加入免疫染色封閉液稀釋抗兔Cy3抗體(封閉液與抗體體積比為100∶1)100 μL,避光室溫孵育1 h。隨后的步驟都要避光進(jìn)行操作。7)洗滌:重復(fù)步驟2)。8)細(xì)胞核染色:加入細(xì)胞核染色液DAPI,室溫染色5 min。9)洗滌:重復(fù)步驟2)。10)熒光倒置顯微鏡觀察。

    1.3.3 乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達(dá)的影響

    HT-29細(xì)胞正常培養(yǎng),傳代進(jìn)行2~3 次,然后進(jìn)行分組:正常對照組、LPS組、實驗組(CGMP組1:10-6mg/mL、CGMP組2:10-5mg/mL、CGMP組3:10-4mg/mL、CGMP組4:10-3mg/mL、CGMP組5:10-2mg/mL)。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h,PBS洗5 min,洗2 次,正常組加入完全培養(yǎng)基,LPS組和實驗組均加入LPS(1 μg/mL),均在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min,然后LPS組和實驗組吸去LPS,之后LPS組加入完全培養(yǎng)基,實驗組加入不同質(zhì)量濃度的乳源CGMP溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,1 200 r/min離心2 次,每次5 min。將得到的上清液直接進(jìn)行8 種炎癥因子的檢測,對于血管生成因子檢測前用截留分子質(zhì)量為3 ku的蛋白超濾管進(jìn)行濃縮,10 000 r/min條件下離心5 次,每次10 min,將細(xì)胞上清液濃縮至1 mL后進(jìn)行測定。其余操作按照試劑盒說明書,在多功能讀板機(jī)測量每個孔在450 nm波長處的吸光度(A450nm)。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 19.0軟件中的Duncan模型進(jìn)行方差分析與多重比較,處理結(jié)果以表示,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細(xì)胞激活NF-κB信號通路

    圖1 不同LPS質(zhì)量濃度刺激下HT-29細(xì)胞免疫熒光圖Fig.1 immunof l uorescence images of HT-29 cells under LPS stimulation at different concentrations

    NF-κB開啟轉(zhuǎn)錄功能的前提是NF-κB(p65)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,而目前研究NF-κB的活化方法主要有凝膠電泳遷移實驗、熒光素酶報告基因測定NF-κB DNA結(jié)合活性以及免疫熒光技術(shù)等技術(shù)。其中免疫熒光技術(shù)可更為簡單直觀地觀察到p65的核移位情況。本研究采用DAPI和Cy3雙色熒光進(jìn)行標(biāo)記。DAPI是一種可以透過完整細(xì)胞膜與DNA強力結(jié)合的藍(lán)色熒光染料,即可對細(xì)胞核內(nèi)的DNA染色而顯示出細(xì)胞核;因此,在熒光顯微鏡下藍(lán)色熒光圖像指示的為細(xì)胞核區(qū);Cy3(箐類染料)是標(biāo)記NF-κB(p65)抗體的紅色熒光染色劑。

    細(xì)胞靜息狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)的NF-κB很少被激活而存在細(xì)胞質(zhì)中,這時的紅色主要為細(xì)胞質(zhì)的NF-κB。而激活后的NF-κB會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,這時細(xì)胞核區(qū)也會出現(xiàn)紅色的熒光,核區(qū)紅色熒光越多,說明轉(zhuǎn)位的NF-κB(p65)越多,以此來代表NF-κB活化的程度。圖1顯示不同質(zhì)量濃度LPS刺激下的免疫熒光圖,不同的濾光鏡分別采取同一視野。由免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),在正常對照組圖1A1中,可清晰地看到呈現(xiàn)紅色熒光的細(xì)胞質(zhì)(圖中未顯示,下同),中間內(nèi)依稀可見空心的部分為細(xì)胞核,在圖1A3中通過與細(xì)胞核的藍(lán)色熒光染色疊加后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核的顏色與疊加前幾乎無差別,說明NF-κB(p65)沒有發(fā)生核移位。而通過觀察經(jīng)LPS刺激后的各組疊加后的圖片,發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了p65從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不同程度地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)的現(xiàn)象。LPS組1疊加圖的胞核區(qū)染色不再是單一的藍(lán)色,伴隨輕微的紫色,原因是NF-κB的核移位使得細(xì)胞核內(nèi)也表現(xiàn)出紅色熒光,當(dāng)紅、藍(lán)顏色疊加后,便出現(xiàn)了藍(lán)紫色。NF-κB活化的程度越大,即核移位越多,胞核區(qū)的染色就越向紫色偏移,比較LPS組1~組4,發(fā)現(xiàn)LPS組3的胞核區(qū)疊加后的紫色更明顯,表明胞核內(nèi)的紅色熒光更多;所以,LPS組3(1 μg/mL)是刺激HT-29細(xì)胞活化NF-κB信號通路的最適劑量。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)考察了乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達(dá)的影響。

    2.2 乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達(dá)的影響

    2.2.1 乳源CGMP干預(yù)激活后的HT-29細(xì)胞的8 種炎癥因子表達(dá)水平

    圖2 各細(xì)胞炎癥因子相對表達(dá)量的比較Fig.2 Comparison of relative expression levels of inf l ammatory factors

    免疫因素是結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的重要因素之一,大量的T淋巴細(xì)胞分泌各種促炎(TNF-α、IFN、IL-1、IL-6、IL-8)和抑炎(IL-4、IL-10)的炎癥因子,還包括趨化因子和集落刺激因子等,這些因子的反饋性又加重炎癥的損傷。采用ELISA試劑盒的方法測定細(xì)胞中炎癥因子相對表達(dá)量的結(jié)果如圖2所示,其中表達(dá)量相對較多的是GMCSF、GCSF、INF-γ、TNF-α、IL-8 5 種因子,剩余3 種因子的表達(dá)量一般。LPS組各種因子都明顯高于對照組和乳源CGMP組。同時綜合8 種因子經(jīng)乳源CGMP的調(diào)節(jié)后,發(fā)現(xiàn)CGMP組2、CGMP組3和CGMP組4的對炎癥因子表達(dá)有明顯的影響。

    2.2.2 乳源CGMP干預(yù)激活后的HT-29細(xì)胞的8 種血管生成因子表達(dá)水平

    腫瘤持續(xù)性生長必須要依賴于血管,血管是腫瘤營養(yǎng)的運輸系統(tǒng),亦是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑。采用ELISA的方法測定的細(xì)胞中血管生成因子相對表達(dá)結(jié)果如圖3所示,發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)與轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)β表達(dá)量最突出,乳源CGMP組不僅極顯著地下調(diào)了LPS刺激后的VEGF分泌,其表達(dá)量也低于正常對照組,具有極顯著性差異。其余的因子也呈現(xiàn)出LPS組的表達(dá)量最大,乳源CGMP均不同程度地抑制了各種因子的表達(dá),總體趨勢均是先降低后升高。

    圖3 各細(xì)胞血管生成因子相對表達(dá)量的比較Fig.3 Comparison of relative expression levels of angiogenic factors

    3 討 論

    NF-κB是一種高度保守的核轉(zhuǎn)錄因子,因其在細(xì)胞內(nèi)參與了炎癥因子的調(diào)控和表達(dá),所以亦稱之為炎癥反應(yīng)鏈上的“基因開關(guān)”。在受到外界的刺激時,NF-κB可迅速產(chǎn)生反應(yīng)而影響機(jī)體。研究指出,NF-κB與結(jié)直腸癌的關(guān)系密切[23],因此研究NF-κB信號通路在結(jié)腸癌的發(fā)展中具有重大意義。

    本研究以體外人源結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為模型,通過觀測p65核移位的現(xiàn)象確定NF-κB信號通路激活狀態(tài),研究用LPS刺激細(xì)胞以確保NF-κB(p65)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。由圖1發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的強弱依賴于LPS的質(zhì)量濃度,LPS的質(zhì)量濃度越高,疊加后的紫色熒光越明顯,充分說明NF-κB信號通路的激活越徹底。Hwang等[24]用LPS(20 μg/mL)刺激人臍靜脈內(nèi)皮血管細(xì)胞,同樣采用熒光技術(shù),發(fā)現(xiàn)LPS可以激活NF-κB。Perkins等[25]以0.01、0.10、1.00 μg/mL的LPS刺激結(jié)腸癌SW620細(xì)胞1、3、6、12 h后測定Toll樣受體、NF-κB,結(jié)果顯示NF-κB的活化與LPS的質(zhì)量濃度和時間均呈現(xiàn)依賴性,表明1 μg/mL是最適的劑量,與本實驗結(jié)果相同。本研究為乳源CGMP干預(yù)后的HT-29細(xì)胞在體外細(xì)胞模型中處于激活狀態(tài)提供了保障。事實表明,炎癥反應(yīng)過程中細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)往往與特定免疫信號通路的激活有著必然的聯(lián)系。腸黏膜受到外界刺激后造成NF-κB激活,過量表達(dá)部分炎癥細(xì)胞因子,如前列腺素E2、IL炎癥因子不斷刺激腫瘤細(xì)胞加劇了其發(fā)展轉(zhuǎn)移;進(jìn)一步認(rèn)識炎癥因子對結(jié)直腸癌及其他免疫相關(guān)性疾病的影響機(jī)制有助于降低炎癥性腸病誘發(fā)腸道腫瘤的概率[12]。近年來,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB已被研究得較為透徹,絕大多數(shù)人認(rèn)為其在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)才代表NF-κB已具備轉(zhuǎn)錄活性,也有部分人認(rèn)為只有核內(nèi)磷酸化才能證明NF-κB被激活,對于p65的解釋更是充滿爭議。p65的磷酸化可以通過經(jīng)典通路中的細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)中NF-κB激酶抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)的作用也可直接與酪氨酸激酶結(jié)合,然后將其磷酸化。在國內(nèi)的研究中發(fā)現(xiàn)p65蛋白的磷酸化位點具有多個,不同的位點磷酸化可產(chǎn)生不同的效果,其中研究較多的是第536位和第276位的絲氨酸(Ser)。Ser536的磷酸化都被解釋為有助于核因子的轉(zhuǎn)錄,在大鼠肉瘤(ratsarcoma,ras)、蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、核糖體S6蛋白激酶(ribosomal S6 kinase,RSK)通路增強核蛋白體S6能夠直接把核內(nèi)的p65的Ser536磷酸化,通過降低與抑制蛋白IκB的結(jié)合從而增強NF-κB的活性[25-26]。磷酸化p65不僅僅只存在于細(xì)胞核內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也同樣存在,并且影響著p65在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的定位。有研究發(fā)現(xiàn)276位的Ser磷酸化的p65能夠減少p65在細(xì)胞核內(nèi)的積累,基因敲除磷酸化p65的Ser276的蛋白激酶(protein kinases,PKA)會使p65在核內(nèi)的積累增多[27],但也有學(xué)者認(rèn)為Ser276被PKA磷酸化后增強了NF-κB與DNA的親和性。結(jié)合四唑鹽比色法[7]和免疫熒光測定的結(jié)果,并測定了不同質(zhì)量濃度的CGMP對LPS刺激后的細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白的表達(dá),結(jié)果表明實驗組均下調(diào)被LPS刺激的HT-29細(xì)胞內(nèi)p65的表達(dá),質(zhì)量濃度10-5mg/mL和10-4mg/mL的乳源CGMP對p65的作用極其顯著;而低質(zhì)量濃度10-5、10-4mg/mL和10-3mg/mL的乳源CGMP對p65的影響極顯著;其他質(zhì)量濃度CGMP雖也在不同程度上降低了部分蛋白的表達(dá),但與正常對照組相比,都沒有顯著性[7]。Ming Zhu等[8]研究了乳源CGMP對潰瘍性小鼠的影響,測定結(jié)腸組織的核蛋白內(nèi)的p65,揭示了乳源CGMP可以降低模型組的蛋白的表達(dá),本實驗的結(jié)果與其結(jié)論一致。

    目前國內(nèi)外研究CGMP對結(jié)腸癌的抗炎方面還比較少,而大多數(shù)的研究集中在生物活性肽方面,H?versen等[28]的實驗結(jié)果表明乳鐵蛋白可以抑制NF-κB的活性和細(xì)胞因子的表達(dá)量。J?rgensen等[29]以小鼠的腸道細(xì)胞為模型,用LPS刺激細(xì)胞發(fā)現(xiàn),0.1 μg/mL LPS可最大程度活化NF-κB,牛初乳蛋白處理可顯著降低p65的轉(zhuǎn)錄。同時,Majumder[30]和Huang Wuyang[31]等從雞蛋清中提取的三肽可以抑制由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的關(guān)鍵NF-κB信號通路,從而下調(diào)了在血管內(nèi)皮中表達(dá)的炎癥蛋白。本研究的結(jié)果也與以上眾多研究結(jié)論相符,進(jìn)一步說明了乳源CGMP可在炎癥相關(guān)的信號通路中發(fā)揮一定的作用,其作用機(jī)制為乳源CGMP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)直接作用到經(jīng)典信號通路中的結(jié)點蛋白IKK上,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)就阻斷了p65的核移位和Ser536的磷酸化,使得細(xì)胞核的p65在不同程度上降低[6,8]。

    無論是炎癥的產(chǎn)生還是血管的生成終歸咎于促炎因子與抑炎因子、血管生成因子與抑制血管生成因子之間的平衡被打破,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[3]。研究顯示有近25%的腫瘤是由慢性炎癥引發(fā)的,如部分結(jié)腸癌的形成就是由炎癥反復(fù)刺激結(jié)腸黏膜導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎演變的。腸上皮屏障的損傷增加了上皮的通透性,細(xì)菌等進(jìn)入黏膜下層,刺激巨噬細(xì)胞、DCs產(chǎn)生促炎因子(TNF-α、IL-8、IL-1β)。這樣的炎癥微環(huán)境使腫瘤細(xì)胞分泌更多趨化因子和炎癥因子,招募免疫細(xì)胞并激活下游的信號通路。TNF-α可促使NF-κB途徑被激活,趨化巨噬細(xì)胞積累并轉(zhuǎn)錄大量的促炎因子而誘發(fā)結(jié)腸癌;中和TNF-α可以降低結(jié)腸癌的發(fā)生率[32]。腫瘤血管的生成是機(jī)體原有血管直接的實體瘤生長再血管化,血管形成的關(guān)鍵步驟是血管生成因子誘發(fā)細(xì)胞的增殖和游走。1971年Folkman等[33]從Walker256瘤細(xì)胞中提取了一種誘發(fā)血管生成物質(zhì),并正式命其為腫瘤血管生成因子。至今,已發(fā)現(xiàn)10多種血管生成因子,代表有TGF、VEGF、EGF、TNF-α及纖維蛋白等,這些血管生成因子不斷促進(jìn)血管的生成。炎癥因子與血管生成因子存在一定的關(guān)聯(lián),TNF-α不僅具有促炎因子的作用而且還發(fā)揮誘發(fā)血管生成因子的作用。更有研究證明粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子CMSCF在腸炎惡性轉(zhuǎn)化過程中高度表達(dá),在LPS刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞后可分泌CMCSF,更重要的是CMCSF又可促進(jìn)腸道腫瘤上皮細(xì)胞直接釋放VEGF[34]。本結(jié)果顯示LPS刺激HT-29細(xì)胞后,促炎因子中CMCSF的表達(dá)量最高,對應(yīng)的血管生成因子中VEGF也最為明顯,與前人的結(jié)果一致。結(jié)腸癌中的這些因子的轉(zhuǎn)錄由活化的NF-κB控制[35]。對于CMCSF促進(jìn)VEGF的表達(dá)可能與ERK通路存在關(guān)聯(lián),已有研究證明ERK通路也可調(diào)控VEGF的表達(dá),CMCSF通過促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α的入核而誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)[36]。

    4 結(jié) 論

    乳源CGMP具有調(diào)節(jié)激活后的NF-κB信號通路的能力,能有效抑制和改善結(jié)腸癌細(xì)胞的炎癥狀態(tài),其機(jī)制為乳源CGMP可通過顯著下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中NF-κB信號通路的炎癥因子和血管生成因子的表達(dá),從而達(dá)到減緩炎癥的程度。

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