果蔬中多酚類化合物雙向調(diào)控Nrf2/Keap1信號通路的研究進展

賴燈妮，覃 思，趙玲艷，鄧放明*

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128）

Nrf2（NF-E2-related factor2）是調(diào)控細胞抵抗外來異物和氧化損傷、維持細胞內(nèi)氧化還原平衡的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2的缺失或激活障礙導致氧化應激源的細胞毒性增強，引起細胞功能障礙、凋亡甚至死亡，從而與許多疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系[1-3]。因此，激活Nrf2信號通路有利于人體健康和疾病的預防。但是隨著研究的深入，有研究者發(fā)現(xiàn)Nrf2的激活可能阻礙癌癥的治療，如在某些癌癥的化療和放療中，Nrf2的激活增強了癌細胞的抗藥性[4-7]，所以如何在癌細胞中抑制Nrf2的活性也是目前的研究熱點之一。

果蔬中含有豐富的多酚化合物，其酚羥基中鄰位酚羥基極易被氧化，且有較強捕捉活性氧等自由基的能力，因此能夠清除自由基和淬滅活性氧[8]。目前有近1 000 種果蔬多酚化合物被證明利于人體健康和預防疾病（如癌癥、糖尿病、神經(jīng)性疾病等）[9]。果蔬多酚化合物能顯著調(diào)控Nrf2/Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）信號通路，然而其作用的分子機制尚未闡明。本文系統(tǒng)介紹了Nrf2/Keap1信號通路及其調(diào)節(jié)方式，討論了Nrf2化學預防腫瘤和促進癌癥發(fā)生的雙重作用，詳細總結(jié)和分析了關于果蔬中多酚類物質(zhì)對Nrf2/Keap1的激活或抑制作用的研究進展和基本規(guī)律。

1 Nrf2信號通路及其調(diào)節(jié)

1.1 Nrf2/Keap1信號通路及其調(diào)節(jié)

Nrf2是細胞調(diào)節(jié)氧化應激反應的重要轉(zhuǎn)錄因子，屬于CNC（cap’-n’-collar）轉(zhuǎn)錄因子家族成員[10]。Nrf2含有7 個不同的功能區(qū)（圖1），分別命名為Neh1到Neh7（Nrf2-ECH homology）。Neh1區(qū)中CNC-bZIP（leucime zipper bZIP）亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，bZIP與Maf蛋白（包括MafG、MafK、MafF）形成異二聚體。此二聚體是Nrf2識別抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）上DNA基序（GCTGAGTCA）并與之結(jié)合、啟動下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的重要物質(zhì)。Neh2區(qū)上的DLG和ETGE基序是Nrf2與胞漿蛋白Keap1結(jié)合區(qū)，DLG和ETGE缺失或突變影響Nrf2與Keap1結(jié)合，負調(diào)控Nrf2信號通路。在Neh1與Neh2之間，存在Neh4、Neh5、Neh7和Neh6，Neh3在靠近Neh1的末端且結(jié)構(gòu)復雜。Neh4和Neh5與共激活因子CREB結(jié)合蛋白（cyclic AMP-response elememt binding protein (CREB) binding protein，CBP），促使CBP協(xié)同參與激活Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性并增強下游抗氧化基因的表達。Neh6存在著綁定F-box蛋白家族β-TrCP（β-transducing repeats-containing proteins）的區(qū)域和DSGIS目的區(qū)域，合成糖原酶激酶（glycogen synthase kinase 3，GSK3）β和磷酸化Nrf2上的兩個位點，Ser335和Ser338，形成與β-TrCP連接泛素酶的結(jié)構(gòu)，獨立于Keap1起負調(diào)控作用。Neh7存在著一個視黃受體（retinoic X receptor α，RXRα）的一個綁定區(qū)域，與RXRα相互作用[11]。

目前認為Nrf2/Keap1信號通路由3 個部分組成：Keap1、Nrf2、ARE[12-16]。Keap1是Keap1-Cullin 3（Cul3）-Ring box1（Rbx1）E3泛素連接酶的底層調(diào)節(jié)蛋白，與Nrf2結(jié)合并且抑制其活性。ARE是機體內(nèi)重要的保護性順式應答元件，其核心序列是5’-TA/CANNA/GTGAC/TNNNGCAG-3’，存在于大部分細胞保護基因的近端啟動子區(qū)域，是抗氧化蛋白和Ⅱ相脫毒酶基因上游的一段轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段[17]。

圖1 Nrf2結(jié)構(gòu)功能示意圖Fig.1 Functional structure of Nrf2

在一般正常生理狀態(tài)下，細胞質(zhì)中Nrf2中Neh2片段上的ETGE和DLG位點與Keap1結(jié)合。Keap1和Cul-Rbx-E3泛素連接酶偶聯(lián)Neh2賴氨酸殘基從而使Nrf2被泛素化標記，最后被引導進入蛋白酶體進行降解。因此，正常情況下細胞質(zhì)中Nrf2蛋白含量較低[12,18]。在氧化應激和親電反應中，Keap1中半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)改變從而不能與Neh2偶聯(lián)，因此不能泛素化降解掉Nrf2。這樣會導致細胞質(zhì)中Nrf2大量積累并轉(zhuǎn)移到細胞核中，然后在分子伴侶Maf的協(xié)助下與ARE結(jié)合形成二聚體，啟動Ⅱ相脫毒酶和抗氧化蛋白相關基因的表達和蛋白的合成，從而提高細胞抗氧化應激能力[19]。當半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)恢復到穩(wěn)定狀態(tài)時，Keap1又能與Nrf2形成泛素化體系，從而酶解掉Nrf2以恢復其正常水平[20-21]。

目前調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1信號通路主要有兩種假說：鉸鏈和門閂模式和Cul3-Keap1解偶聯(lián)模式（圖2）。

圖2 Nrf2/Keap1信號調(diào)節(jié)模型Fig.2 Regulatory model of Nrf2/Keap1 signaling pathway

1.1.1 鉸鏈和門閂模式

在鉸鏈和門閂模式中，Keap1連接Nrf2中高親和性ETGE位點形成二聚體，稱為“打開”結(jié)構(gòu)。隨后Keap1與Nrf2中DLG位點結(jié)合形成“關閉”結(jié)構(gòu)。在生理狀態(tài)下，Nrf2/Keap1關閉結(jié)構(gòu)使得Nrf2在細胞質(zhì)中被泛素化標記從而被蛋白酶降解，解鏈的Keap1則進入下一個與Nrf2結(jié)合的循環(huán)。但在氧化應激狀態(tài)下，活性氧自由基和電子修飾Keap1中IVR區(qū)半胱氨酸殘基結(jié)合從而使其結(jié)構(gòu)變化。雖然結(jié)構(gòu)變化的Keap1依舊能連接Nrf2的ETGE和DLG位點，但是與E2泛素結(jié)合酶卻不能在一條直線上連接，因此Nrf2不被降解并得到積累[22-24]。

1.1.2 Cul3-Keap1解偶聯(lián)模式

Cul3-Keap1解偶聯(lián)模式中，一些誘導劑（如叔丁基對苯二酚或二十五烯酸影響Cul3和Keap1結(jié)合。Keap1中BTB區(qū)的C151是這個模式中的關鍵位點，它結(jié)構(gòu)的改變使Cul3不能與之偶聯(lián)從而Nrf2不被泛素化。在兩種模式中Nrf2是否泛素化是其積累和核轉(zhuǎn)運的關鍵[25-27]。

1.2 獨立于Keap1的Nrf2調(diào)節(jié)通路

雖然Keap1是調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路的重要因素，但其他因素也影響Nrf2通路，主要包括蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子以及表觀遺傳調(diào)節(jié)。

1.2.1 蛋白激酶

蛋白激酶是依賴一類胞內(nèi)信使，且在蛋白質(zhì)磷酸化過程中起中介和放大作用并協(xié)助完成信號傳遞的酶。磷酸化是影響Nrf2信號通路的重要因素，其中主要的蛋白激酶包括PKC蛋白激酶C、PI3K磷脂酰肌醇激酶、MAPKs絲裂酶原激活蛋白酶（細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/p38）[28]。研究發(fā)現(xiàn)果蔬多酚化合物的木犀草素、花色苷、表兒茶素能夠磷酸化ERK；原花青素B2、表兒茶素能夠磷酸化p38；蘇木查爾醇能夠磷酸化JNK；阿魏酸、表兒茶素以及黑茶茶多酚能夠磷酸化PI3K通路并激活Nrf2通路。早期研究發(fā)現(xiàn)Nrf2中Ser40、Ser568位點磷酸化使Nrf2表達增強，但Ser215、Ser408、Ser577位點磷酸化卻抑制著Nrf2通路的激活[29-31]。PKC磷酸化Nrf2中Ser40位點，使Nrf2與Keap1分離，誘導其轉(zhuǎn)入胞核[32]。目前針對MAPKs調(diào)控Nrf2的研究結(jié)果充滿爭議，有研究結(jié)果表明MAPKs對Nrf2有正向調(diào)控作用，Nrf2誘導劑叔丁基對苯二酚和萊菔硫烷抑制MAPKs的ERK和p38活性，降低ARE相關基因的表達[33]。而有些報道則發(fā)現(xiàn)MAPKs對Nrf2有負向調(diào)控作用，在A549細胞中ERK抑制劑抑制Nrf2的Ser40磷酸化從而阻止其核轉(zhuǎn)錄，p38抑制劑SB203580促進Nrf2與Keap1解偶聯(lián)從而使其泛素化，在HepG2細胞中，發(fā)現(xiàn)p38負調(diào)控Nrf2[34-36]。PI3K激酶控制Nrf2的激活，PI3K激酶的抑制劑阻止Nrf2的核轉(zhuǎn)移和氧化應激蛋白的誘導[37]。從上述文獻可以看出：部分蛋白激酶的磷酸化是多酚調(diào)控Nrf2信號通路的前提和必要條件；其中，果蔬多酚化合物磷酸化PKC蛋白激酶從而激活Nrf2-ARE信號通路，而磷酸化MAPKs激酶的果蔬多酚化合物對Nrf2信號通路的調(diào)節(jié)目前尚未有一致的報道，磷酸化PI3K激酶的果蔬多酚則激活Nrf2信號通路。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子是指能夠結(jié)合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活域或抑制域）、寡聚化位點以及核定位信號等4 個功能區(qū)域組成。轉(zhuǎn)錄因子功能差異主要由激活域和抑制域決定，其中包括激活因子和抑制因子[38]。

Nrf2的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制非常復雜，它們是獨立于Keap1調(diào)控Nrf2通路的因子。例如Maf蛋白通過改變Nrf2亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)以及同源延伸區(qū)從而影響其二聚化，敲掉Maf蛋白會影響Nrf2的激活以及抗氧化蛋白的誘導[39]。另外，核內(nèi)共同激活因子3（amplified in breast 1，AIB1）通過增強轉(zhuǎn)錄活性影響Nrf2的激活[40]。其中Nrf2激活因子包括重組人Jun二聚化蛋白2（Jun dimerization protein 2，JDP2）、Jun、CBP、BRG1、p21[41-44]。而Nrf2抑制因子包括cFos、p53、p65、Fra1、Bach1、C/EBPα、ATF1、ATF3 ER、SFERRβ、PPAR-Y、RAR-α[45-48]。

1.2.3 表觀遺傳學調(diào)控

表觀遺傳學是在細胞核內(nèi)DNA序列沒有改變的情況下基因功能可逆的可遺傳改變[49]。正常細胞CpG島處于非甲基化或低甲基化。研究表明在人體和小鼠中Nrf2啟動子上CpG甲基化抑制Nrf2的表達[50-51]。在BEAS-2B細胞中，Keap1啟動子的CpG甲基化負調(diào)節(jié)Keap1的表達[52]。組蛋白乙酰化由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases，HDACs）兩個家族的酶調(diào)控。HDACs對于Nrf2的調(diào)控首先發(fā)現(xiàn)于炎癥模型中。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）通過刺激HDACs降低組蛋白H3和H4的乙?；瘜е翹rf2通路失活，然而通過HDACs抑制劑此過程可逆[53]。在BEAS-2B細胞中或者在HDAC2敲除的細胞中，HDACs抑制劑可使得Nrf2通路失活，這說明HDACs調(diào)節(jié)Nrf2是一個復雜的過程[50]。

由于Nrf2在生理學上的重要作用，Nrf2的調(diào)控機制的研究已成為腫瘤學和藥物學研究的熱點。Nrf2不僅受Keap1調(diào)控，而且受獨立于Keap1的蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子以及表觀遺傳學等因素的調(diào)控。在某些情況下，Nrf2獨立于Keap1的調(diào)控機制在慢性疾病中起著至關重要的作用。因此，研究多重調(diào)控Nrf2的機制在治療慢性疾病中有著深遠的意義。

2 Nrf2/Keap1信號通路的雙重功效：癌癥的化學預防和促進作用

Nrf2對癌癥有化學預防和促進癌癥進程的雙重作用：一方面，Nrf2對健康機體癌變的化學預防有著至關重要的作用[54]；另一方面，Nrf2異常表達和持續(xù)性活躍能促進癌變進程，或者減弱針對癌癥的化療和放療效果[55]。因此尋求一種在正常機體激活Nrf2信號通路且在腫瘤中抑制Nrf2信號通路的多酚化合物是目前研究的熱點。

2.1 Nrf2/Keap1對癌癥的化學預防作用

目前認為Nrf2/Keap1的激活是細胞抗氧化還原反應和抑制腫瘤的關鍵步驟。在敲除基因Nrf2-/-小鼠體內(nèi)實驗中，利用化學毒素刺激小鼠，發(fā)現(xiàn)肺部、肝臟和腎臟中出現(xiàn)嚴重損傷。乙酰氨基酚刺激Nrf2-/-小鼠從而引起急性肝臟毒性[56]；丁羥甲苯或氧過多誘導Nrf2-/-小鼠導致其肺部損害[57-58]。另外，Nrf2-/-小鼠更易得氧化相關的疾病和癌癥[59]。研究發(fā)現(xiàn)人體Nrf2的啟動子的單核苷酸多態(tài)性使得Nrf2的表達下降，從而使肺癌患病幾率提高，具體地來說，Nrf2基因的上游啟動子區(qū)域（rs6721961）的變異削弱了Nrf2與ARE結(jié)合力從而使得肺癌患病率顯著上升[60]。因此激活Nrf2被認為是癌癥化學預防的有效途徑。大量的研究表明Nrf2-ARE的激活劑通過誘導Nrf2/Keap1的表達和提高抗氧化水平從而達到抵御相關疾病的目的[61-62]。

2.2 Nrf2/Keap1促進癌癥的作用

2.2.1 Nrf2/Keap1促進癌癥發(fā)展

以往對Nrf2/Keap1的研究都集中于它對細胞的抗氧化性和解毒功能，認為其在癌癥預防中發(fā)揮著至關重要的作用。然而最新研究發(fā)現(xiàn)Nrf2持續(xù)異常激活將促進癌癥發(fā)生同時阻礙癌癥治療，如化療和放療作用[63]。在肝、肺、乳腺、膀胱、卵巢、胰腺、子宮癌的研究中發(fā)現(xiàn)Nrf2的表達增強[64-66]。Nrf2/Keap1的激活受到不同因素影響，如磷脂酰肌醇激酶（PI3K/Akt）、抗細胞凋亡蛋白（B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2））、自噬通路、炎癥因子（核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB））以及致癌基因（kRas和bRaf）[64,67]。

Nrf2/Keap1上調(diào)節(jié)下游抗氧化、解毒酶的表達以及抑制細胞凋亡的功能對癌細胞起到保護和增殖作用[68]。如癌細胞中Nrf2通過PI3K/Akt通路、表皮生長因子促進癌細胞的增殖和新陳代謝[69]。此外，Nrf2/Keap1直接誘導抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL干擾癌細胞的凋亡[70]。肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)Nrf2持續(xù)異常激活與腫瘤的新陳代謝密切相關[66]，然而敲除Nrf2的癌細胞能夠減緩細胞的轉(zhuǎn)移及腫瘤的新陳代謝[67]。

2.2.2 Nrf2/Keap1抗化療和放療的作用

治療癌癥過程中，化療和放療起著非常重要的作用。在腫瘤細胞中Nrf2/Keap1的異常激活阻礙著化療和放療的作用[71]。RNA干擾技術(shù)使Nrf2表達沉默或者Keap1過量表達導致癌細胞對藥物或者化療放療的敏感性[4]。目前研究者對腫瘤細胞Nrf2的異常激活從而阻礙化療和放療的現(xiàn)象提出了多種假設：1）Nrf2下游抗氧化蛋白和解毒酶如HO-1和GST阻礙細胞的死亡從而起到抗化療和放療的作用[72]；2）Nrf2誘導抗藥物蛋白（MRPs）削弱藥物對癌細胞的作用[73]；3）Nrf2與細胞凋亡之間的交互作用[32]；4）Nrf2誘導癌細胞中的蛋白酶，從而達到保護癌細胞的目的[74]；5）一些抗癌藥物通過與Keap1的Cys151位點結(jié)合，激活Nrf2抑制某些蛋白酶從而達到抗化療的作用[75]。

目前Nrf2作為預測和評價治療癌癥是否有效的生物指標，Nrf2/Keap1是否高水平表達已經(jīng)成為臨床治療中藥物有效與否的評判標準，因此對Nrf2的研究在臨床診斷和治療中發(fā)揮著至關重要的作用。

3 果蔬中多酚化合物調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1通路

表1 果蔬中幾種典型多酚對Nrf2/Keap1通路的影響Table1 Regulatory effect of typical dietary polyphenols on Nrf2/Keap1 signaling

多酚化合物廣泛存在于水果、蔬菜等植物性食物中，具有抗炎癥、腫瘤、氧化以及治療心血管疾病和骨質(zhì)疏松等多種生物活性。多酚類植物化合物中能激活或者促進Nrf2的表達的，稱為激活劑；而抑制或者削弱Nrf2的表達的稱為抑制劑[76]。但是隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)不同劑量的果蔬多酚在不同細胞或動物模型中，調(diào)控Nrf2信號通路效果復雜多變。在體外實驗中多酚化合物調(diào)控Nrf2信號通路的劑量效應基本呈現(xiàn)倒U型曲線，即低劑量時多酚類化合物能夠激活Nrf2信號通路，當劑量超過閾值則抑制Nrf2信號通路（表1）。

3.1 木犀草素

木犀草素是一種天然3,4,5,7-四羥基黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜和水果中，如芹菜、胡椒、青椒、蘋果皮和洋蔥的葉子等。在肺癌細胞A549中，木犀草素通過獨立于Keap1信號通路降低Nrf2的mRNA和蛋白質(zhì)的表達從而下調(diào)Nrf2-ARE信號通路。研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L的木犀草素刺激A549細胞30 min后Nrf2的mRNA水平降低了34%，且提高了A549對藥物的敏感性。然而利用RNA干擾技術(shù)使Nrf2基因在細胞中表達沉默后，木犀草素誘導的細胞對藥物的敏感性消失[77]。在結(jié)腸癌細胞HCT116和SW620中，木犀草素通過降低NQO1/HO-1/GSTα1/GSTα2的表達從而抑制Nrf2通路[78]。在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)通過木犀草素治療的小鼠的Nrf2蛋白含量降低，肝臟和腸的腫瘤變小[78]。這說明在肺癌細胞A549、結(jié)腸癌細胞HCT116和SW620以及在小鼠模型中，木犀草素作為Nrf2的抑制劑通過使Nrf2表達下降從而達到提高抗癌藥物敏感性的作用。在神經(jīng)性細胞PC12中，木犀草素通過獨立于Keap1的磷酸化通路ERK增強Nrf2-ARE信號通路以及下游HO-1的mRNA的表達[79]。在肝癌細胞HepG2中，木犀草素通過獨立于Keap1的磷酸化通路PI3K增強Nrf2的表達[80]。用1.2 mg/（kg·d）木犀草素喂養(yǎng)氧化偶氮甲烷誘導的小鼠腸癌模型中發(fā)現(xiàn)Nrf2表達增加從而達到治療腫瘤的目的[81]。這說明木犀草素作為Nrf2的激活劑，促進Nrf2在細胞中的表達。

在體外實驗中，可以發(fā)現(xiàn)1～10 μmol/L的木犀草素刺激癌細胞A549、HCT116和SW620后，降低了細胞中Nrf2蛋白的表達[75,78]。但是1.56～6.25 μmol/L的木犀草素刺激癌細胞HepG2后，發(fā)現(xiàn)其Nrf2蛋白的表達增強了[80]。在體內(nèi)實驗中：用40 mg/kg的木犀草素喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)抑制了Nrf2蛋白的表達[78]；而用1.2 mg/kg的木犀草素喂養(yǎng)小鼠后，發(fā)現(xiàn)激活了Nrf2蛋白的表達[81]。但是0～20 μmol/L的木犀草素刺激正常細胞PC12，激活了Nrf2蛋白的表達[79]（表1）。從以上數(shù)據(jù)可以看出，高劑量的木犀草素在癌細胞和體外實驗中都是Nrf2的抑制劑，而低劑量的木犀草素則是Nrf2的激活劑。然而，木犀草素在正常細胞中對Nrf2的影響則沒有以上規(guī)律。在腸道中木犀草素以糖苷或硫酸鹽形式被吸收，雖然木犀草素在血漿中的含量較低且持續(xù)時間較短，但依舊表現(xiàn)出較強的生物活性。

3.2 芹黃素

芹黃素是一種天然的4,5,7-三羥基黃酮類化合物，廣泛存在于芹菜等果蔬中。大量文獻報道芹黃素的作用機理是通過PI3K/Akt通路抑制Nrf2[80-82]。芹黃素在肝癌細胞BEL-7402中通過負調(diào)控PI3K/Akt通路降低Nrf2的mRNA和蛋白表達從而提高其對抗腫瘤藥物敏感性[82]。芹黃素刺激胚胎成纖維細胞通過下調(diào)PI3K/PKC/p38/ERK通路使Nrf2以及下游蛋白HO-1表達下降[83]。在體內(nèi)實驗中，通過芹黃素治療肝癌小鼠發(fā)現(xiàn)其腫瘤變小[82]。研究發(fā)現(xiàn)芹黃素刺激肝癌細胞HepG2通過PI3K通路增強Nrf2蛋白表達[80]。芹黃素通過CpG去甲基化削弱DNA的甲基化和組蛋白脫乙?；?，從而激活皮膚表皮JB6P+細胞Nrf2的表達[84]。芹黃素刺激肝細胞通過增強細胞核內(nèi)Nrf2與ARE的綁定與磷酸化ERK2從而提高GSH蛋白的表達[85]。

在體外實驗中，10～20 μmol/L芹黃素刺激肝癌細胞BEL-7402發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2表達[82]，但是1.56～6.25 μmol/L芹黃素刺激肝癌細胞H e p G 2激活N r f 2表達[80]。5～40 μmol/L芹黃素刺激胚胎成纖維細胞發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2信號通路[83]。0.00～6.25 μmol/L芹黃素刺激上皮細胞JB6P+、5～25 μmol/L芹黃素刺激肝細胞Hepatocyte發(fā)現(xiàn)都激活Nrf2的表達[84-85]（表1）。從以上數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)：無論是在癌細胞還是正常細胞中芹黃素激活Nrf2的劑量都低于抑制Nrf2的劑量；芹黃素作為Nrf2的激活劑，刺激癌細胞的劑量比正常細胞的低。

木犀草素和芹黃素是日常飲食中微量的小分子物質(zhì)。分子結(jié)構(gòu)上木犀草素比芹黃素多一個羥基，因此木犀草素的抗氧化能力較強。大鼠口服單一劑量菊花提取物（200 mg/kg），其中木犀草素和芹黃素含量分別為5.2%和7.6%。芹黃素和木犀草素吸收達到最高值分別為237.6、23.03 μg·h/mL且均小于4 h（芹黃素3.9 h，木犀草素1.1 h）。這兩種多酚類化合物72 h后在糞便和尿液中總回收率低于Ⅱ相代謝產(chǎn)物50%。芹黃素和木犀草素的分布體積、腎清除率以及消除半衰期分別為13.78 L/kg、0.856 9 L/（kg/h）、3.4 h和65.12 L/kg、8.473 L/（kg/h）、2.7 h，且在濃度1.56～6.25 μmol/L范圍內(nèi)，木犀草素顯示出更強激活Nrf2的能力[80]。

3.3 表兒茶素

表兒茶素主要存在于茶葉、蓮子皮、葡萄等果蔬中，主要通過抑制活性氧簇和丙二醛的產(chǎn)生和提高GSH-Px活性從而達到抗氧化和抗腫瘤的作用。高濃度的表兒茶素在肺癌細胞A549中通過抑制Nrf2-ARE的綁定和下游蛋白HO-1蛋白的表達從而誘導細胞凋亡[86]。從肉桂中提取的表兒茶素通過下調(diào)Nrf2調(diào)節(jié)酶從而抑制肺癌細胞A549中Nrf2的過量表達，且提高細胞對阿霉素和依托泊苷藥物的敏感性和細胞內(nèi)的藥物累積[87]。這些結(jié)果表明表兒茶素通過降低Nrf2的過量表達從而有效降低肺癌細胞對抗癌藥物的耐藥性。目前發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2的過量表達是協(xié)助治療肺癌的一種新方法。

通過表兒茶素誘導內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)GST和NQO1蛋白表達增強，這暗示著Nrf2表達上調(diào)[88]。在狗腎細胞MDCK中，表兒茶素通過誘導細胞質(zhì)以及細胞核中Nrf2的表達增強使得抗氧化酶活性增加，利用干擾siRNA技術(shù)敲除基因Nrf2從而表兒茶素的作用消失[89]。在宮頸癌細胞HeLa中，表兒茶素增強Nrf2信號通路以及下游蛋白HO-1的表達以提高對藥物順鉑的敏感性[90]。表兒茶素刺激HUVEC增強Nrf2和HO-1的表達[91]。這些結(jié)果表明表兒茶素作為Nrf2的激活劑，可以起到抗氧化和輔助治療癌癥的作用。

在體外實驗中，高劑量的表兒茶素（大于200 μmol/L）處理A549細胞，能夠抑制其Nrf2的表達[86]，而低劑量的表兒茶素處理細胞則能夠激活Nrf2的表達[87]。如表1所示，以25～50 μmol/L的表兒茶素刺激內(nèi)皮細胞，25 μmol/L表兒茶素刺激MDCK和宮頸癌細胞，以及50～200 μmol/L的表兒茶素刺激HUVEC，這些低劑量的表兒茶素均能激活細胞中Nrf2的表達[88,90-91]。

3.4 花色苷

自然狀態(tài)下，花色素常與各種糖原結(jié)合形成糖苷的形式，稱為花色苷。目前已知近百種花色素，較為常見的花色素有6 種，即矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素、牽牛色素、芍藥色素和錦葵色素。目前研究認為花色苷作為Nrf2的激活劑，還沒有相關抑制Nrf2的活性的報道。紫色馬鈴薯中提取的花色苷誘導DMN處理的HepG2細胞，通過激活Nrf2途徑從而上調(diào)HO-1、GST和NAD(P)H表達[92]。Shih等[93]發(fā)現(xiàn)矢車菊素、飛燕草色素、錦葵色素不僅可以激活Nrf2作用于ARE，誘導Ⅱ相抗氧化蛋白谷胱甘肽還原酶、GSH-Px、NQO1等的表達，從而抑制半胱天冬酶-3的活性，而且能抑制LPS、IFN-γ誘導的NF-κB活化，通過作用于PI3K和MAPKs途徑，抑制前列腺素E2和一氧化氮的產(chǎn)生。花色苷在人體上皮細胞中通過ERK1/2通路激活Nrf2從而達到抗氧化作用[94]（表1）。

3.5 阿魏酸

阿魏酸含有不飽和雙鍵和羥基的酚酸結(jié)構(gòu)，是蘋果、咖啡等果蔬中主要的多酚化合物。它主要的功效為抗氧化和清除自由基、抑制血栓形成、抗血小板凝聚等。在巨噬細胞Raw264.7中，阿魏酸主要通過降低Nrf2的表達從而下調(diào)NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，且通過IKK/NF-κB的信號通路達到抗炎癥的作用[95]。研究表明HUVEC中通過阿魏酸激活PI3K和ERK信號通路使得Nrf2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，且增強下游蛋白GSH和NAD(P)H表達[96]。在淋巴球細胞中阿魏酸顯著上調(diào)HO-1的mRNA以及蛋白水平，誘導Nrf2的核轉(zhuǎn)運[97]。

0.2 ～5.0 μmol/L阿魏酸刺激HUVEC、0.001～0.100 μmol/L刺激淋巴細胞都是激活Nrf2的表達[96-97]，但是100 μmol/L阿魏酸刺激巨噬細胞則是抑制Nrf2的表達[95]（表1）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)體外實驗低劑量的阿魏酸在正常的細胞中是Nrf2的激活劑，高劑量的阿魏酸則為其抑制劑。

目前發(fā)現(xiàn)果蔬中的多酚化合物大部分雙向調(diào)節(jié)Nrf2，在體外實驗中，同種多酚化合物作為Nrf2抑制劑濃度普遍比激活劑濃度高。推測果蔬多酚化合物雙向調(diào)節(jié)Nrf2劑量呈倒U型曲線，即當濃度低于閾值對于Nrf2起到激活作用，但超過閾值則起抑制作用。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)當攝入50 mg多酚化合物糖苷配基時，總代謝物在血漿中的濃度為0～4 μmol/L，尿排泄為攝入劑量的0.3%～43.0%，且不同的多酚化合物的代謝濃度不同：其中吸收最好的多酚是沒食子酸和異黃酮，其次是兒茶素、黃烷酮和槲皮素糖苷，但具有不同的動力學；吸收最少的多酚是原花色素、沒食子?；膬翰杷睾突ㄇ嗨豙98]。體內(nèi)實驗中多酚類物質(zhì)被動物或人體吸收后的血清濃度與大部分體外實驗細胞模型起作用的濃度相差較大，這可能是目前制約多酚在人體臨床上應用的最大原因。

4 結(jié) 語

果蔬多酚化合物不僅雙向調(diào)控Nrf2/Keap1信號通路，并且調(diào)控炎癥通路、細胞凋亡和自噬，Nrf2/Keap1和其他通路之間的交互作用的機制研究能夠給預防和治療慢性疾病帶來新方法。所以Nrf2/Keap1與炎癥通路、細胞凋亡和自噬之間的交互作用也是目前研究的熱點。NF-κB和Nrf2之間的相互作用影響細胞黏附分子和谷胱甘肽的體內(nèi)平衡[99]。NF-κB的異常激活與炎癥和疾病的產(chǎn)生有著密不可分的聯(lián)系[100]。Nrf2是重要的轉(zhuǎn)錄和免疫調(diào)節(jié)因子，它通常能抑制或者抵消NF-κB信號。例如敲除Nrf2的小鼠引起炎癥的幾率更大[101]。最新研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠直接抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平，NF-κB與Nrf2位點存在CBP競爭從而影響Nrf2信號通路的表達[102]。

一系列研究發(fā)現(xiàn)Nrf2通過誘導Ⅱ相酶表達來調(diào)節(jié)細胞凋亡與自噬。由于Keap1是Nrf2信號通路泛素化的必要元件，任何影響Keap1的因素都影響Nrf2-ARE通路。Keap1與細胞凋亡密切相關的PGAM5（phosphoglycerate mutase 5）、ProTα、FAC1（fetal Alz-50 clone1）、P62（SQSTM1）蛋白結(jié)合，勢必會引起Nrf2信號通路與細胞凋亡之間的交互作用[103]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2阻礙LPS誘導的PC12細胞自噬[104]。

應用Nrf2調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化平衡，已經(jīng)成為疾病預防以及靶位點治療的新策略。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Nrf2在癌癥治療上有雙重作用，Nrf2的抑制劑和激活劑在預防和治療癌癥上具有重要的意義。多酚化合物作為日常飲食果蔬中富含的成分，對于誘導抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶的表達、減輕氧化應激損傷起著積極有效的作用。大量的研究表明果蔬多酚化合物作用于Nrf2轉(zhuǎn)錄、翻譯、降解以及細胞核運輸階段（圖3），但是其具體的分子機制以及劑量效應仍需要更加深入的闡明。這對拓展果蔬多酚化合物最新的研究領域和范圍具有重要意義。

圖3 Nrf2轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達機理Fig.3 Mechanisms of Nrf2 transcription, translation and expression

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