流式分析技術(shù)快速定量檢測牛乳中大腸桿菌O157:H7

劉思淵，古少鵬*，隋志偉*，劉思章，薛 蕾，霍乃蕊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

隨著國內(nèi)生活水平的提升，牛乳的消費(fèi)量呈逐年上升的趨勢[1]，但同時(shí)也面臨著食品安全方面的威脅。一方面，牛乳從養(yǎng)殖場到工廠的生產(chǎn)過程中被食源性致病菌污染的可能性很高；另一方面，牛乳中豐富的脂肪、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)給食源性致病菌提供了良好的增殖條件[2]。根據(jù)調(diào)查顯示，牛乳中食源性致病菌主要有大腸桿菌O157:H7、沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌等[3-6]。

大腸桿菌O157:H7是一種重要的食源性致病菌，屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是腸出血性大腸桿菌中最具代表性的血清型[7]。自1982年首次在美國發(fā)現(xiàn)由大腸桿菌O157:H7引起出血性腸炎的爆發(fā)以來，在全球范圍內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)了多起大腸桿菌O157:H7食物中毒事件[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1996—2004年間，大腸桿菌O157:H7平均每年造成約4億 美元的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重危害人類身體健康[9]。大腸桿菌O157:H7的主要宿主是牛[10]，并且世界各地的乳及乳制品中都曾有大腸桿菌O157:H7的檢出，特別是在美國、瑞典、意大利的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌O157:H7在牛乳樣品中有著較高的檢出率[3,11-12]。因此，牛乳被認(rèn)為是大腸桿菌O157:H7污染的高風(fēng)險(xiǎn)食品之一，大腸桿菌O157:H7的檢測也得到了世界各國的廣泛重視。

目前，牛乳中大腸桿菌O157:H7的檢測主要依靠常規(guī)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)方法，然而培養(yǎng)方法耗時(shí)費(fèi)力，無法適應(yīng)大規(guī)模篩查檢測的需求[13]。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的新方法被應(yīng)用于牛乳中細(xì)菌的檢測。杜寒春等[14]運(yùn)用阻抗法檢測牛乳中的細(xì)菌總數(shù)，但其無法特異地檢測牛乳中特定的細(xì)菌；王文彬[15]建立的免疫膠體金試紙條的方法檢測牛乳中大腸桿菌O157:H7，其肉眼檢測限僅能達(dá)到3×105CFU/mL；蓋冬雪[16]和張微[17]等使用PCR方法可以檢測牛乳中的細(xì)菌，但該方法在對(duì)實(shí)際牛乳樣品的檢測中，由于受到PCR檢測模板體系較少等限制，不僅會(huì)造成較高的漏檢率，且操作相對(duì)復(fù)雜。流式分析技術(shù)在細(xì)菌檢測領(lǐng)域有著快速、高效的優(yōu)點(diǎn)[18]，因此，將其用于牛乳中細(xì)菌檢測的研究也愈加受到重視。劉道亮等[19]基于流式分析技術(shù)完成了牛乳中細(xì)菌總數(shù)的檢測，所用的檢測時(shí)間為100 min；Pinder等[20]對(duì)牛乳中沙門菌進(jìn)行了檢測，其檢測下限達(dá)到了104CFU/mL；He Shengbin等[21]對(duì)酸乳中乳酸菌進(jìn)行了檢測，但其檢測范圍為106～109CFU/mL。而基于流式分析技術(shù)檢測牛乳大腸桿菌O157:H7的研究中，Yamaguchi等[22]已將其檢測時(shí)間縮短到了90 min。然而目前流式分析方法仍難以滿足乳及乳制品生產(chǎn)企業(yè)和市場監(jiān)管日益增長的快速、準(zhǔn)確檢測的要求。

本研究以大腸桿菌O157:H7為檢測對(duì)象，結(jié)合流式分析技術(shù)和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，建立了一種牛乳中大腸桿菌O157:H7的快速定量檢測方法。該方法旨在進(jìn)一步縮短大腸桿菌O157:H7檢測時(shí)間、提高定量檢測的準(zhǔn)確性，從而滿足牛乳中大腸桿菌O157:H7快速定量檢測的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂滅菌乳 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司。

大腸桿菌O157:H7（CICC 21530）、大腸桿菌（CMCC 44102）、大腸桿菌K12（ATCC 10798）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538P）、陰溝腸桿菌（ATCC 13047）和弗氏檸檬酸桿菌（ATCC 43864）均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂（VRBA-MUG） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；標(biāo)記有異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyante，F(xiàn)ITC）的大腸桿菌O157單克隆抗體 美國Virostat公司；牛奶中微生物快速純化試劑盒 北京亦泰生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A50-Micro型流式細(xì)胞儀 英國Apogee公司；1-14型離心機(jī) 德國Sigma公司；HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DNP-9272型恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌懸濁液的制備

將大腸桿菌O157:H7、大腸桿菌（CMCC 44102）、大腸桿菌K12、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌分別接種于20 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液，12 000×g離心10 min，棄去上清液，底部沉淀用1 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）重懸。用滅菌的PBS將重懸后的大腸桿菌O157:H7純菌液進(jìn)行10 倍系列稀釋。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7的染色

吸取兩份適宜濃度的大腸桿菌O157:H7菌液（最終濃度約為107CFU/mL），其中一份菌液與FITC標(biāo)記的大腸桿菌O157單克隆抗體（最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL）避光孵育15 min作為實(shí)驗(yàn)組，另一份菌液作為對(duì)照組，用流式分析儀進(jìn)行檢測。

熒光染料FITC的激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長為519 nm，呈現(xiàn)綠色熒光[23]。因此，流式分析儀檢測參數(shù)設(shè)定如下：激發(fā)光波長488 nm，分析速率10.5 μL/min，檢測時(shí)間30 s，通過488-Grn綠色熒光通道進(jìn)行檢測分析。

1.3.3 大腸桿菌O157:H7與抗體反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了探索大腸桿菌O157:H7與FITC標(biāo)記的大腸桿菌O157單克隆抗體的最佳反應(yīng)條件，參照王寧[24]的方法，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。大腸桿菌O157:H7（最終濃度約為108CFU/mL）分別與不同質(zhì)量濃度的抗體（0.01、0.1、1、2 μg/mL）避光孵育15 min，每個(gè)質(zhì)量濃度做3 次重復(fù)，隨后進(jìn)行流式分析，計(jì)算染色率，確定抗體最適質(zhì)量濃度。

大腸桿菌O157:H7（最終濃度約為108CFU/mL）與熒光抗體（最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL）進(jìn)行避光孵育，時(shí)間分別為5、10、15、20 min和25 min。每個(gè)條件做3 次重復(fù)，再用流式分析儀進(jìn)行檢測，計(jì)算染色率，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.4 流式檢測方法的線性與靈敏度[25]

將用滅菌PBS 10 倍系列稀釋的大腸桿菌O157:H7菌液分別采用流式檢測法和國標(biāo)中大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法[26]進(jìn)行定量檢測，每個(gè)濃度分別用流式檢測法和平板計(jì)數(shù)法做3 次重復(fù)。分析流式檢測法的線性與靈敏度。

1.3.5 流式檢測方法的特異性檢測[27]

用滅菌的PBS分別將大腸桿菌（CMCC 44102）、大腸桿菌K12、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸菌等常見致病菌制備成107CFU/mL菌懸液，分別與FITC標(biāo)記的大腸桿菌O157單克隆抗體（最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL）避光孵育15 min，用流式分析儀進(jìn)行檢測，驗(yàn)證其特異性。

1.3.6 人工污染牛乳樣品的檢測

將大腸桿菌O157:H7人工接種到牛乳中，制備成人工污染的牛乳樣品，濃度為1.51×103～1.51×108CFU/mL。采用牛乳中微生物快速純化試劑盒去除牛乳樣品中的脂肪和蛋白顆粒，對(duì)人工污染的牛乳樣品進(jìn)行如下處理：取0.5 mL牛乳置于2 mL離心管中，再取牛乳中微生物快速純化試劑盒的樣品處理液1 mL置于牛乳中，反復(fù)顛倒混勻20 次，12 000×g離心5 min。棄去上層脂肪和中層清液，保留底部的沉淀。加入500 μL的PBS重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再加入1 mL的PBS，混勻后，12 000×g離心5 min。棄去上清液，保留底部沉淀，加入500 μL的PBS重懸沉淀。再經(jīng)過熒光抗體孵育后，用流式分析儀進(jìn)行檢測。每個(gè)濃度的樣品做3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FITC標(biāo)記大腸桿菌O157:H7的檢測結(jié)果

將FITC標(biāo)記的單克隆抗體與大腸桿菌O157:H7孵育15 min后，用流式分析儀進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組的大腸桿菌O157:H7可以檢測到綠色熒光，而對(duì)照組未檢測到綠色熒光，證明大腸桿菌O157:H7與FITC標(biāo)記的單克隆抗體可以發(fā)生反應(yīng)，并通過流式分析技術(shù)可以在20 min內(nèi)快速檢測到大腸桿菌O157:H7。

圖1 FITC標(biāo)記大腸桿菌O157:H7Fig. 1 Detection of E. coli O157:H7 labelled with FITC

2.2 大腸桿菌O157:H7與抗體反應(yīng)條件的優(yōu)化

將大腸桿菌O157:H7（最終濃度約為108CFU/mL）分別于不同質(zhì)量濃度的抗體（0.01、0.1、1、2 μg/mL）避光孵育15 min，隨后進(jìn)行流式分析，通過計(jì)算抗體不同質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間條件下的染色率，如表1所示，大腸桿菌O157:H7的染色率隨著所用抗體質(zhì)量濃度的升高而升高，當(dāng)抗體質(zhì)量濃度為1 μg/mL時(shí)，染色率趨于穩(wěn)定，因此抗體的最佳質(zhì)量濃度為1 μg/mL。此外，大腸桿菌O157:H7的染色率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)染色率趨于穩(wěn)定，因此抗體與大腸桿菌O157:H7的反應(yīng)時(shí)間為15 min。

表1 不同抗體反應(yīng)條件下大腸桿菌O157:H7的染色率Table 1 Staining rate of E. coli O157:H7 under different reaction conditions with the antibody

2.3 流式檢測方法的線性與靈敏度結(jié)果

將用滅菌PBS進(jìn)行10 倍系列稀釋的大腸桿菌O157:H7菌液采用流式方法進(jìn)行檢測，同時(shí)對(duì)每一個(gè)稀釋度的菌液采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示（表2），大腸桿菌O157:H7的濃度在103～108CFU/mL時(shí)，流式分析技術(shù)檢測大腸桿菌O157:H7的結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法基本一致，且流式檢測法與平板計(jì)數(shù)法之間線性良好（R2=0.997 2）。大腸桿菌O157:H7的濃度大于108CFU/mL時(shí)，由于流式分析儀自身的限制，超出其檢測上限。當(dāng)大腸桿菌O157:H7的濃度小于103CFU/mL時(shí)，流式分析結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法偏差較大。流式檢測方法在PBS中的檢測范圍為2.57×103～1.12×108CFU/mL，靈敏度為2.57×103CFU/mL。

表2 流式檢測與平板計(jì)數(shù)法檢測大腸桿菌O157:H7的結(jié)果（n= 3）Table 2 Comparison of the results of FCM method and plate counting method in detection of E. coli O157:H7(n= 3)

2.4 流式檢測方法的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大腸桿菌（CMCC 44102）、大腸桿菌K12、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌分別與大腸桿菌O157單克隆抗體在優(yōu)化條件下進(jìn)行反應(yīng)，上述5 種菌株在流式分析儀中均未檢測到綠色熒光（表3）。結(jié)果表明：大腸桿菌O157單克隆抗體與大腸桿菌（CMCC 44102）、大腸桿菌K12、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌不發(fā)生反應(yīng)，表明建立的流式檢測方法特異性良好。

表3 流式檢測方法的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Specificity of flow counting method for E. coli O157:H7

2.5 人工污染牛乳樣品的檢測結(jié)果

在牛乳中接種不同濃度梯度的大腸桿菌O157:H7。用牛乳中微生物快速純化試劑盒對(duì)人工污染的牛乳樣品進(jìn)行前處理。樣品與處理液反復(fù)顛倒混勻，高速離心后，樣品分離為3 層，分別為上層的脂肪層、中間的透明液體以及底部沉淀，其中底部沉淀是經(jīng)純化的大腸桿菌O157:H7；而用同樣體積的純水作為對(duì)照代替牛乳中微生物快速純化試劑盒來處理人工污染的牛乳樣品時(shí)，當(dāng)牛乳樣品與純水顛倒混勻并離心后，底部仍殘留有較多的白色沉淀，沉淀不僅包含人工污染的大腸桿菌O157:H7，還含有較多的和蛋白顆粒。通過與純水的對(duì)比說明，牛乳中微生物快速純化試劑盒可以完成對(duì)大腸桿菌O157:H7的純化。

表4 人工污染牛乳樣品中流式檢測方法與平板計(jì)數(shù)方法檢測結(jié)果的比較（n=3）Table 4 Comparison of quantitative results of E. coli O157:H7 in artificially infected milk samples between FCW and plate counting method (n= 3)

將經(jīng)過純化的大腸桿菌O157:H7，用流式分析進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4所示，大腸桿菌O157:H7的濃度在104～108CFU/mL之間時(shí)，流式檢測方法與平板計(jì)數(shù)方法的檢測結(jié)果非常接近。大腸桿菌O157:H7的濃度小于104CFU/mL時(shí)，流式檢測方法與平板計(jì)數(shù)方法的檢測結(jié)果偏差較大。因此，人工污染牛乳樣品中流式檢測方法的檢測范圍為2.31×104～1.48×108CFU/mL，靈敏度為2.31×104CFU/mL。

3 討 論

大腸桿菌O157:H7的污染是食品安全領(lǐng)域中的重要問題。因此，建立快速高效檢測方法是控制其污染的有效手段之一[27]。本研究通過偶聯(lián)FITC的單克隆抗體特異性標(biāo)記大腸桿菌O157:H7，結(jié)合流式分析技術(shù)，建立了一種牛乳中大腸桿菌O157:H7的快速定量檢測方法。

熒光抗體在流式分析儀檢測單一細(xì)菌的方法中應(yīng)用廣泛，且抗體的特異性對(duì)方法的特異性起著至關(guān)重要的作用[25,27]。本研究將偶聯(lián)FITC的大腸桿菌O157單克隆抗體與大腸桿菌O157:H7以及其他5 種常見菌株進(jìn)行反應(yīng)，所得結(jié)果證明了流式分析技術(shù)檢測大腸桿菌O157:H7的特異性。

流式分析技術(shù)檢測牛乳中的細(xì)菌時(shí)，需要對(duì)樣品進(jìn)行一定的前處理來排除牛乳中大分子蛋白和脂肪的干擾。通常的前處理方法為：用蛋白酶降解大分子蛋白質(zhì)，用TritonX-100破碎牛乳中的體細(xì)胞，通過離心完成脂肪的分離[20-22,24,28]，整個(gè)過程用時(shí)30 min。本研究所用的牛乳中微生物快速純化試劑盒，將純化的時(shí)間縮短到了15 min，但缺點(diǎn)是步驟比較繁瑣，對(duì)操作者有較高的要求。

目前，平板培養(yǎng)法是細(xì)菌檢測最權(quán)威最通用的方法，但是國標(biāo)中大腸桿菌O157:H7的檢測僅為定性檢測，難以滿足食品安全領(lǐng)域中定量檢測的需求[13]。因此，本研究中對(duì)大腸桿菌O157:H7的平板計(jì)數(shù)方法參照國標(biāo)中大腸埃希氏菌的平板計(jì)數(shù)方法[26]。本研究對(duì)流式檢測結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，證明了流式檢測方法具有良好的線性，其并且檢測結(jié)果與平板計(jì)數(shù)方法基本一致，有望滿足食品安全領(lǐng)域中大腸桿菌O157:H7定量檢測的需求。該方法在PBS中的檢測限為2.57×103～1.12×108CFU/mL，在牛乳樣品中的檢測限為2.31×104～1.48×108CFU/mL，與前人文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果十分接近[22]。相信隨著大腸桿菌O157:H7富集技術(shù)的逐步改進(jìn)，該方法的靈敏度可進(jìn)一步提升[25,29]。

此外，流式分析技術(shù)檢測牛乳中大腸桿菌O157:H7的過程中，牛乳樣品前處理的時(shí)間為15 min，大腸桿菌O157:H7與抗體的反應(yīng)時(shí)間為15 min，流式檢測與結(jié)果分析的時(shí)間約為5 min，合計(jì)35 min。與平板計(jì)數(shù)法、阻抗法、膠體金試紙條法以及PCR方法相比較，檢測時(shí)間明顯縮短[14-17,30]，有望滿足食品安全領(lǐng)域中大腸桿菌O157:H7快速檢測的需求。

流式分析技術(shù)對(duì)樣品溶液有比較嚴(yán)格的要求，任何與待測目標(biāo)顆粒直徑相近的雜質(zhì)顆粒都會(huì)影響檢測結(jié)果。牛乳的成分十分復(fù)雜，前處理方法難以完全消除牛乳中的雜質(zhì)成分。所以使用流式分析儀檢測牛乳中大腸桿菌O157:H7，當(dāng)濃度接近103CFU/mL時(shí)，檢測結(jié)果偏差較大且重復(fù)性差（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為46.40%）。實(shí)際牛乳加工過程中要求大腸桿菌O157:H7不得檢出，而流式檢測方法有一定的檢測下限，所以目前方法應(yīng)用于實(shí)際牛乳檢測尚有一定的困難。本研究在牛乳中大腸桿菌O157:H7的快速定量檢測中做了有益嘗試，同時(shí)，在今后的工作中不斷優(yōu)化細(xì)菌的富集方法，進(jìn)一步提升該方法的靈敏度，推動(dòng)該方法在實(shí)際檢測樣品中的應(yīng)用。

綜上所述，本研究成功建立起一種新的大腸桿菌O157:H7的檢測方法，并且一定濃度范圍內(nèi)可替代平板培養(yǎng)法，有望滿足牛乳中大腸桿菌O157:H7快速定量檢測的需要。相信隨著方法的不斷優(yōu)化和成熟，再配上效果良好的細(xì)菌富集技術(shù)，其有望實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的快速篩查和監(jiān)控，降低食源性疾病的感染幾率。

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